Dallimi kryesor – Klonimi i gjeneve kundrejt PCR
Sinteza e shumë kopjeve të ADN-së nga një fragment specifik i ADN-së quhet amplifikimi i ADN-së. Ekzistojnë dy procese kryesore të amplifikimit të ADN-së, përkatësisht klonimi i gjeneve dhe PCR. Dallimi kryesor midis klonimit të gjeneve dhe PCR është se klonimi i gjeneve prodhon kopje të shumta të një gjeni specifik in vivo duke ndërtuar një ADN rekombinante dhe duke u rritur brenda një bakteri pritës ndërsa PCR prodhon miliona kopje të një fragmenti specifik të ADN-së in vitro duke iu nënshtruar cikleve të përsëritura të denatyrimi dhe sinteza.
Çfarë është klonimi i gjeneve?
Klonimi i gjenit është një teknikë e përdorur për të lokalizuar dhe shumëzuar një gjen specifik nga ADN-ja gjenomike e ekstraktuar e një organizmi përmes ndërtimit të ADN-së rekombinante. ADN gjenomike përmban mijëra gjene të ndryshme të koduara për proteinat. Kur ADN-ja nxirret, ajo përfshin të gjitha gjenet e mundshme që mund të mbajë. Teknika e klonimit të gjeneve ka mundësuar zbulimin e një gjeni specifik nga ADN-ja totale. Prandaj, klonimi i gjeneve shërben si një mjet i rëndësishëm në biologjinë molekulare.
Krijimi i një biblioteke gjenomike të një organizmi është thelbësor në klonimin e gjeneve nëse nuk ka të dhëna për vendndodhjen e gjenit përkatës në ADN. Një bibliotekë gjenomike është bërë duke përdorur hapat e mëposhtëm.
Hapi 1: Nxjerrja e ADN-së totale nga një organizëm që përmban gjenin e dëshiruar.
Hapi 2: Kufizoni tretjen e ADN-së së nxjerrë për të prodhuar fragmente të vogla të menaxhueshme. Ky hap lehtësohet nga endonukleazat kufizuese.
Hapi 3: Përzgjedhja e një vektori të përshtatshëm dhe hapja e ADN-së vektoriale duke përdorur të njëjtat endonukleaza kufizuese. Plazmidet bakteriale zakonisht përdoren si vektorë për të bartur ADN-në e huaj. Plazmidet janë rrathë të vegjël të ADN-së të vendosura brenda baktereve.
Hapi 4: Kombinimi i ADN-së vektoriale dhe ADN-së së fragmentuar për të prodhuar molekulën rekombinante të ADN-së. Ky hap udhëhiqet nga ligaza e ADN-së.
Hapi 5: Transferimi i molekulave të ADN-së rekombinante në bakteret pritëse. Ky hap njihet si transformim dhe bëhet duke përdorur një goditje nxehtësie.
Hapi 5: Ekzaminimi i qelizave bakteriale të transformuara në një mjedis kulture. Një popullatë e përzier e qelizave pritëse të transformuara dhe jo të transformuara fitohet në fund të procesit të transformimit. Si gjen me interes përfshin vetëm qelizat pritëse të transformuara. Prandaj, është e nevojshme të zgjidhni qelizat e transformuara. Përzgjedhja bëhet duke përdorur media selektive të cilat përmbajnë antibiotikë. Vetëm qelizat e transformuara rriten në këtë medium kontrolli duke mundësuar përzgjedhjen.
Hapi 6: Rritja e baktereve për të prodhuar një bibliotekë gjenesh. Në këtë hap, qelizat pritëse të transformuara futen në mjedise të freskëta të kulturës, e cila siguron kërkesa optimale të rritjes. Kolonitë totale në pllakat e kulturës përfaqësojnë bibliotekën gjenomike të atij organizmi.
Hapi 7: Molekula e ADN-së rekombinante që përmban gjenin me interes duhet të ekzaminohet nga mijëra fragmente të klonuara të ADN-së rekombinante. Ajo mund të realizohet me përdorimin e sondave që shënojnë gjenin specifik ose proteinën specifike rezulton nga ai gjen.
Pasi të identifikohet gjeni i interesuar që përmban koloninë bakteriale nga totali i kolonive, është e mundur të bëhen miliona kopje të plazmidit rekombinant që përmban gjenin.
Klonimi i gjeneve përdoret në krijimin e bibliotekave të gjeneve, prodhimin e proteinave speciale, vitaminave, antibiotikëve, hormoneve, renditjen dhe hartografimin e gjenomave të organizmave, bërjen e kopjeve të shumta të ADN-së së individëve në mjekësi ligjore etj.
Figura_1: Klonimi i gjeneve
Çfarë është PCR?
Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) është një teknikë që gjeneron një numër të madh kopjesh të një fragmenti të veçantë të ADN-së. Amplifikimi eksponencial i një sekuence specifike të ADN-së merret me PCR në kushte in vitro. Kjo teknikë është një mjet shumë i fuqishëm në Biologjinë Molekulare pasi mund të shumëzojë një mostër të vogël të ADN-së në një sasi të përdorshme. PCR u prezantua nga Kary Mullis në 1983 dhe kjo shpikje fituese e çmimit krijoi një përparim të madh në Biologjinë Molekulare.
Teknika
PCR ndjek reaksionet e përsëritura PCR siç tregohet në Figurën 02. Një reagim PCR përbëhet nga tre hapa kryesorë që ndodhin në tre temperatura të ndryshme; denatyrimi i ADN-së me dy zinxhirë në 94 0C, pjekja e primerëve në 68 0C dhe zgjatja e vargut në 72 0 C. Prandaj, kur kryhet PCR, luhatja e temperaturës duhet të mbahet shumë për replikimin e duhur. PCR kryhet në një makinë PCR brenda tubave PCR. Tubat PCR ngarkohen me përzierje të sakta PCR që përmbajnë ADN-në shabllon, Taq polimerazë, primerë, dNTP dhe bufer. Denatyrimi i ADN-së së mostrës dyvargëshe në ADN me një zinxhir bëhet duke thyer lidhjet hidrogjenore ndërmjet bazave plotësuese në 94 – 98 0C. Pastaj fijet e vetme të ADN-së së shabllonit ekspozohen për abetare. Duhet të sigurohen një palë abetare (përpara dhe mbrapa) dhe ato duhet të jenë të qëndrueshme ndaj temperaturës për të toleruar temperaturat e larta. Primerët janë sekuenca të shkurtra të ADN-së me një zinxhir, që plotësojnë skajet e fragmentit të ADN-së së synuar. Në PCR përdoren primerët sintetikë. Primerët lidhen me bazat plotësuese të ADN-së së mostrës dhe nisin sintezën e një vargu të ri. Ky hap katalizohet nga një enzimë e quajtur Taq polimeraza; një enzimë e polimerazës së ADN-së termostabile e izoluar nga Thermus auqaticus. Kur primerët dhe nukleotidet (blloqet ndërtuese) janë të disponueshme, Taq polimeraza ndërton vargun e ri të ADN-së plotësuese për shabllonin e ADN-së. Në fund të programit PCR, fragmenti i ADN-së i përforcuar vërehet duke përdorur elektroforezë xhel. Nëse kërkohet analiza e mëtejshme, produkti PCR pastrohet nga xheli.
PCR është shumë e dobishme për diagnostikimin dhe monitorimin e sëmundjeve gjenetike dhe të fituara, identifikimin e kriminelëve (në fushën e mjekësisë ligjore), studimin e strukturës dhe funksionit të një segmenti të synuar të ADN-së, renditjen dhe hartëzimin e gjenomave të organizmave, etj. PCR është bërë një teknikë rutinë laboratorike në laboratorët e kërkimit të biologjisë mjekësore dhe molekulare midis shkencëtarëve, pasi ajo ka një shumëllojshmëri të gjerë aplikimesh.
Figura_2: Reaksioni zinxhir i polimerazës
Cili është ndryshimi midis Klonimit të Gjenit dhe PCR?
Klonimi i gjeneve vs PCR |
|
| Klonimi i gjenit është procesi i bërjes së kopjeve të shumta të një gjeni specifik in vivo përmes ADN-së rekombinante dhe transformimit në një bakter pritës. | Teknika PCR prodhon kopje të shumta të një sekuence të veçantë të ADN-së in vitro përmes cikleve të përsëritura të reaksioneve PCR. |
| Kërkesa për ndërtimin e ADN-së rekombinante | |
| ADN-ja rekombinante prodhohet për të lokalizuar gjenin. | ADN-ja rekombinante nuk prodhohet. |
| Nevoja për Punë | |
| Ky proces është intensiv i punës. | Nuk nevojitet punë intensive. |
| Proces in vivo ose in vitro | |
| Ndërtimi i ADN-së rekombinante është in vitro dhe amplifikimi i ADN-së është in vivo. | Amplifikimi i ADN-së ndodh plotësisht in vitro. |
Përmbledhje – Klonimi i gjeneve kundrejt PCR
Klonimi i gjenit dhe PCR janë dy metoda të përdorura për amplifikimin e ADN-së. PCR është një proces in vitro i cili bën kopje të shumta të ADN-së të një fragmenti të veçantë të ADN-së pa përdorur ADN-në rekombinante dhe një organizëm pritës. Klonimi i gjeneve është kryesisht një proces in vivo që rezulton në kopje të shumta të një gjeni të interesuar brenda organizmit pritës nëpërmjet ndërtimit të ADN-së rekombinante. Ky është ndryshimi midis klonimit të gjeneve dhe PCR.
