Diferenca kryesore – NGS vs Sekuenca Sanger
Next Generation Sequencing (NGS) dhe Sanger Sequencing janë dy lloje të teknikave të renditjes së nukleotideve të zhvilluara me kalimin e kohës. Metoda Sanger Sequencing u përdor gjerësisht për shumë vite dhe NGS e zëvendësoi së fundmi për shkak të avantazheve të saj. Dallimi kryesor midis NGS dhe Sanger Sequencing është se NGS funksionon në parimin e sekuencës së miliona sekuencave në të njëjtën kohë në një mënyrë të shpejtë përmes një sistemi sekuencimi ndërsa Sanger Sequencing punon në parimin e përfundimit të zinxhirit për shkak të përfshirjes selektive të dideoksinukleotideve nga enzima e polimerazës së ADN-së. gjatë replikimit të ADN-së dhe ndarjes së fragmenteve që rezulton me elektroforezë kapilar.
Çfarë është sekuenca nukleotide?
Informacioni gjenetik ruhet në sekuencat nukleotide të ADN-së ose ARN-së së një organizmi. Procesi i përcaktimit të rendit të saktë të nukleotideve (duke përdorur katër baza) në një fragment të caktuar (në një gjen, grup gjenesh, kromozom dhe gjenom të plotë) njihet si sekuenca nukleotide. Është shumë e rëndësishme në studimet gjenomike, studimet mjeko-ligjore, virologjinë, sistematikën biologjike, diagnozën mjekësore, bioteknologjinë dhe në shumë fusha të tjera të analizohet struktura dhe funksioni i gjeneve. Ekzistojnë lloje të ndryshme të metodave të renditjes të zhvilluara nga shkencëtarët. Midis tyre, sekuenca Sanger e zhvilluar nga Frederick Sanger në 1977 u përdor gjerësisht dhe u popullarizua për një periudhë të gjatë kohore deri sa e zëvendësoi atë nga Renditja e Gjeneratës së ardhshme.
Çfarë është NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) është një term që përdoret për t'iu referuar proceseve moderne të renditjes së xhiros së lartë. Ai përshkruan një sërë teknologjish të ndryshme moderne të renditjes që revolucionarizuan studimet gjenomike dhe Biologjinë Molekulare. Këto teknika janë sekuenca e Illumina, sekuenca Roche 454, sekuenca e protoneve jonike dhe sekuenca SOLID (Sekuenca nga zbulimi i lidhjes së Oligo). Sistemet NGS janë më të shpejta dhe më të lira. Katër metoda kryesore të renditjes së ADN-së përdoren në sistemet NGS, përkatësisht; pirosekuenca, sekuenca me sintezë, sekuenca me lidhje dhe sekuenca e gjysmëpërçuesit jonik. Një numër i madh i vargjeve të ADN-së ose ARN-së (miliona) mund të renditen paralelisht. Ai lejon renditjen e të gjithë gjenomit të organizmave brenda një periudhe të shkurtër kohore, ndryshe nga sekuenca Sanger që kërkon më shumë kohë.
NGS ka shumë përparësi ndaj metodës konvencionale të renditjes Sanger. Është një proces me shpejtësi të lartë, më të saktë dhe me kosto efektive që mund të kryhet me një madhësi të vogël kampioni. NGS mund të përdoret në studimet metagjenomike, në zbulimin e variacioneve brenda një gjenomi individual për shkak të futjeve dhe fshirjeve etj. dhe në analizën e shprehjeve të gjeneve.
Figura_1: Zhvillimet në Sekuencën NGS
Çfarë është Sekuenca Sanger?
Sanger Sequencing është një metodë sekuencimi e zhvilluar nga Frederick Sanger dhe kolegët e tij në 1977 për të përcaktuar rendin e saktë të nukleotideve të një fragmenti të caktuar të ADN-së. Njihet gjithashtu si sekuenca e përfundimit të zinxhirit ose sekuenca Dideoksi. Parimi i punës i kësaj metode është përfundimi i sintezës së vargut me inkorporim selektiv të një dideoksinukleotidesh (ddNTPs) që përfundojnë zinxhirin si ddGTP, ddCTP, ddATP dhe ddTTP nga ADN polimeraza gjatë replikimit të ADN-së. Nukleotidet normale kanë grupe 3' OH për formimin e një lidhje fosfodiesterike midis nukleotideve ngjitur për të vazhduar formimin e vargut. Sidoqoftë, ddNTP-ve u mungon ky grup 3' OH dhe nuk janë në gjendje të formojnë lidhje fosfodiesterike midis nukleotideve. Kështu, zgjatimi i zinxhirit ndërpritet.
Në këtë metodë, ADN-ja me një zinxhir që do të sekuencohet shërben si varg shabllon për sintezën e ADN-së in vitro. Kërkesa të tjera janë primeri oligonukleotid, prekursorët deoksinukleotid dhe enzima e polimerazës ADN. Kur dihen skajet anësore të fragmentit të synuar, primerët mund të dizajnohen lehtësisht për replikimin e ADN-së. Katër reaksione të veçanta të sintezës së ADN-së kryhen në katër tuba të veçantë. Çdo tub ka ddNTP të veçanta, së bashku me kërkesat e tjera. Nga nukleotidi i veçantë, shtohet një përzierje dNTP dhe ddNTP. Po kështu, katër reaksione të veçanta kryhen në katër tuba me katër përzierje. Pas reaksioneve, kryhet zbulimi i fragmenteve të ADN-së dhe shndërrimi i modelit të fragmentit në informacion sekuence. Fragmentet e ADN-së që rezultojnë denatyrohen nga nxehtësia dhe ndahen me elektroforezë xhel. Nëse përdoren nukleotide radioaktive, modeli i brezit në xhelin e poliakrilamidit mund të vizualizohet me anë të autoradiografisë. Kur kjo metodë përdor dideoksinukleotidet e etiketuara në mënyrë fluoreshente, ajo mund të zbutet në xhelin e lexuar dhe të kalohet përmes një rreze lazeri për t'u zbuluar nga detektori fluoreshent. Për të shmangur gabimet që mund të lindin kur një sekuencë lexohet me sy dhe futet manualisht në një kompjuter, kjo metodë u zhvillua në përdorimin e sekuencuesit të automatizuar të shoqëruar me kompjuterin.
Kjo është metoda e përdorur për të renditur ADN-në nga projekti i Gjenomit Njerëzor. Kjo metodë është ende në përdorim me modifikime të avancuara sepse jep informacion të saktë të sekuencës pavarësisht se është një proces i shtrenjtë dhe i ngad altë.
Figura_2: Sekuenca Sanger
Cili është ndryshimi midis NGS dhe Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) i referohet proceseve moderne të renditjes së xhiros së lartë. Ai përshkruan një sërë teknologjish të ndryshme moderne të renditjes | Sanger Sekuenca është një metodë sekuencimi e zhvilluar nga Frederick Sanger për të përcaktuar rendin e saktë të nukleotideve të një fragmenti të caktuar të ADN-së. |
| Efektiviteti i kostos | |
| NGS është një proces më i lirë sepse redukton kohën, fuqinë e njeriut dhe kimikatet. | Ky është një proces i kushtueshëm sepse kërkon kohë, fuqi njerëzore dhe më shumë kimikate. |
| Shpejtësia | |
| Kjo është më e shpejtë pasi zbulimi kimik dhe zbulimi i sinjalit të shumë fijeve po ndodhin paralelisht. | Kjo kërkon shumë kohë pasi zbulimi kimik dhe zbulimi i sinjalit ndodh si dy procese të veçanta dhe vetëm në fillesë mund të lexojnë në të njëjtën kohë. |
| Besueshmëri | |
| NGS është i besueshëm. | Sekuenca e Sanger është më pak e besueshme |
| Madhësia e kampionit | |
| NGS kërkon më pak sasi të ADN-së. | Kjo metodë ka nevojë për një sasi të madhe ADN-je shabllon. |
| Bazat e ADN-së për fragment të renditur | |
| Numri i bazave të ADN-së për fragment të renditur është më i ulët se metoda Sanger | Sekuencat gjeneruese janë më të gjata se sekuencat NGS. |
Përmbledhje – NGS vs Sanger Sequencing
NGS dhe Sanger Sequencing janë teknika të renditjes së nukleotideve të përdorura gjerësisht në Biologjinë Molekulare. Sekuenca e Sanger është një metodë e hershme e renditjes e cila u zëvendësua nga NGS. Dallimi kryesor midis NGS dhe Sanger Sequencing është se NGS është një proces me shpejtësi të lartë, më i saktë dhe me kosto efektive sesa sekuenca Sanger. Të dyja teknikat krijuan shpërthime të mëdha në Gjenetikë dhe Bioteknologji.
