Dallimi kryesor midis analizave PCR konvencionale të mbivendosur dhe në kohë reale është se PCR konvencionale është një teknikë e zhvilluar për të përforcuar sekuenca specifike të ADN-së dhe PCR e ndërlidhur është një modifikim i PCR-së konvencionale që përbëhet nga dy reaksione amplifikimi të njëpasnjëshëm, ndërsa real -PCR në kohë është një variant i PCR-së konvencionale që është në gjendje të përcaktojë sasinë e produktit të përforcuar.
PCR është një teknikë shumë e zakonshme shkencore e përdorur gjerësisht në kërkime dhe mjekësi për të zbuluar ADN-në. Testet PCR përdoren për të zbuluar antigjenet duke zbuluar ADN-në ose ARN-në e tyre. Në përgjithësi, ARN virale është e pranishme në trup përpara se të zbulojë antitrupat ose të shfaqë simptomat e sëmundjes. Një test PCR mund të tregojë nëse dikush e ka apo jo virusin herët. Aktualisht, PCR është testi standard për zbulimin e sëmundjes COVID-19. Ekzistojnë lloje të ndryshme të teknikave të PCR si PCR në kohë reale, PCR e ndërlidhur, PCR multipleks, PCR e fillimit të nxehtë dhe PCR me rreze të gjatë, etj.
Çfarë janë analizat konvencionale të PCR?
Analija konvencionale PCR është një teknikë in vitro e amplifikimit të ADN-së e kryer në mënyrë rutinore në laboratorët biologjikë molekularë. Kjo metodë mundësoi prodhimin e mijëra deri në miliona kopjeve të një fragmenti të veçantë të ADN-së. Kary Mullis e prezantoi këtë teknikë në vitin 1980. Kjo teknikë kërkon një fragment të ADN-së të njohur si shabllon në mënyrë që të bëjë shumë kopje të saj. Taq polimeraza funksionon si enzimë e polimerazës së ADN-së dhe katalizon sintezën e vargjeve të reja të sekuencës së shabllonit.
Primerët në përzierjen PCR do të funksionojnë si pika fillestare për zgjatimet e fragmenteve. Të gjithë përbërësit që janë të nevojshëm për të bërë kopje të ADN-së përfshihen në përzierjen PCR. Reagimi PCR kryhet në një makinë PCR dhe duhet të ushqehet me përzierjen e duhur PCR dhe programin e duhur PCR. Nëse përzierja e reagimit dhe programi janë të sakta, ajo do të prodhojë numrin e kërkuar të kopjeve të një seksioni të caktuar të ADN-së nga një sasi shumë e vogël ADN-je.
Figura 01: Analiza konvencionale PCR
Ka tre hapa kryesorë të përfshirë në një reaksion PCR: denatyrimi, pjekja e primerit dhe zgjatja e vargut. Këto tre hapa ndodhin në tre temperatura të ndryshme. Buferi PCR ruan kushtet optimale për veprimin e polimerazës Taq. Këto tre faza të reagimit PCR përsëriten për të prodhuar sasinë e nevojshme të produktit PCR. Në çdo reagim PCR, numri i kopjeve të ADN-së dyfishohet. Prandaj, amplifikimi eksponencial mund të vërehet në PCR. Produkti PCR mund të zgjidhet duke përdorur elektroforezën e xhelit pasi prodhon një sasi të dukshme të ADN-së në xhel dhe mund të pastrohet për studime të mëtejshme si sekuenca.
PCR është një mjet i vlefshëm në kërkimet mjekësore dhe biologjike. Sidomos në studimet mjekoligjore, PCR ka një vlerë të jashtëzakonshme pasi mund të amplifikojë ADN-në për studime nga mostrat e vogla të kriminelëve dhe të bëjë profile të ADN-së mjeko-ligjore. PCR përdoret gjerësisht në shumë fusha të biologjisë molekulare, duke përfshirë, gjenotipizimin, klonimin e gjeneve, zbulimin e mutacioneve, sekuencën e ADN-së, mikrogrumbullimet e ADN-së dhe testimin e atësisë.
Çfarë janë analizat e PCR të Nested?
PCR e ndërlidhur është një lloj PCR që redukton amplifikimin jospecifik të ADN-së. Ekzistojnë dy PCR të njëpasnjëshme ose dy reaksione të njëpasnjëshme të amplifikimit në analizën e PCR të vendosur. Gjatë reaksionit të parë të amplifikimit, prodhohet një produkt PCR. Pas reagimit të parë, një reaksion i dytë përforcues kryhet në produktin PCR të reaksionit të parë. Prandaj, primerët në përzierjen e reaksionit të dytë lidhen me produktin e parë të PCR dhe e amplifikojnë atë.
Figura 02: PCR i mbivendosur
Çiftet e abetares janë të ndryshme në çdo reagim. Lidhja jospecifike e primerëve zvogëlohet në PCR të vendosura. Analizat e mbivendosura PCR janë të dobishme për të rritur ndjeshmërinë dhe/ose specifikën. Megjithatë, PCR e mbivendosur kërkon njohuri për sekuencën e interesuar.
Çfarë janë analizat PCR në kohë reale?
PCR në kohë reale ose PCR sasiore (Q PCR) është një version i modifikuar i PCR që mat produktet PCR në mënyrë sasiore. Prandaj, kjo teknikë përcakton sasinë e amplifikimit në kohë reale duke përdorur një makinë PCR në kohë reale. Është gjithashtu një metodë e përshtatshme për përcaktimin e sasisë së një sekuence të synuar ose gjenit të pranishëm në një mostër.
Veçoria interesante e PCR-së në kohë reale është se ajo kombinon si amplifikimin ashtu edhe sasinë e vërtetë në një hap të vetëm. Prandaj, nevoja për elektroforezë xhel për zbulim mund të eliminohet me teknikën PCR në kohë reale. Përdorimi i ngjyrave fluoreshente për të etiketuar produktet PCR gjatë reaksioneve PCR përfundimisht do të çojë në kuantifikimin e drejtpërdrejtë. Kur produktet PCR grumbullohen, akumulohen edhe sinjalet fluoreshente dhe ato do të maten nga makineria në kohë reale. SYBR Green dhe Taqman janë dy metoda për të zbuluar ose parë procesin e amplifikimit të PCR në kohë reale. Të dyja metodat monitorojnë ecurinë e procesit të amplifikimit dhe raportojnë sasinë e produktit në kohë reale.
Figura 03: PCR në kohë reale
PCR në kohë reale ka një shumëllojshmëri të gjerë aplikimesh si kuantifikimi i shprehjes së gjeneve, analiza e mikroRNA dhe ARN jo-koduese, gjenotipizimi i SNP, zbulimi i varianteve të numrit të kopjeve, zbulimi i mutacioneve të rralla, zbulimi i organizmave të modifikuar gjenetikisht dhe zbulimi i agjentëve infektivë.
Cilat janë ngjashmëritë ndërmjet analizave konvencionale të mbivendosur dhe PCR në kohë reale?
- Analizat PCR të vendosura dhe në kohë reale janë modifikime të analizës konvencionale PCR.
- Të tre teknikat amplifikojnë mostrat e ADN-së.
- Produktet e tyre mund të përdoren në renditje ose analizë.
- Këto analiza kërkojnë primerë.
Cili është ndryshimi midis analizave konvencionale të mbivendosur dhe PCR në kohë reale?
PCR konvencionale është një teknikë e zhvilluar për të amplifikuar sekuenca specifike të ADN-së. Ndërkohë, Nested PCR është një modifikim i PCR-së konvencionale që përbëhet nga dy reaksione amplifikimi sekuencial, dhe PCR në kohë reale është një variant i PCR-së konvencionale që është në gjendje të përcaktojë sasinë e produktit të përforcuar. Pra, ky është ndryshimi kryesor midis analizave konvencionale të mbivendosur dhe PCR në kohë reale. Ndryshe nga PCR konvencionale dhe në kohë reale, PCR e vendosur përdor dy grupe primerash. Për më tepër, ekzistojnë dy reaksione të njëpasnjëshme të amplifikimit në PCR të mbivendosur për të reduktuar amplifikimin jospecifik. përveç kësaj, analizat PCR konvencionale dhe në kohë reale nuk përmbajnë dy reaksione të njëpasnjëshme të amplifikimit.
Infografia e mëposhtme liston ndryshimet midis analizave PCR konvencionale të mbivendosur dhe në kohë reale në formë tabelare për krahasim krah për krah.
Përmbledhje – Analiza PCR konvencionale vs Nested vs në kohë reale
PCR konvencionale është teknika e parë e zhvilluar për të amplifikuar fragmente specifike të ADN-së. Nested PCR dhe PCR në kohë reale janë dy variante të PCR konvencionale. Ekzistojnë dy reaksione të njëpasnjëshme të amplifikimit dhe përdorimi i dy grupeve të primerëve në PCR të vendosura. PCR në kohë reale është zhvilluar për të përcaktuar sasinë e produktit të përforcuar të PCR. Kështu, kjo përmbledh ndryshimin midis analizave konvencionale të mbivendosur dhe PCR në kohë reale.
