Dallimi kryesor midis Golden Gate dhe Gibson Assembly është se Golden Gate mbështetet në praninë e vendeve të kufizimit brenda një sekuence të veçantë për t'u klonuar, ndërsa Gibson Asambleja nuk mbështetet në praninë e vendeve kufizuese brenda një sekuence të veçantë të klonohen.
Gjatë dekadave të fundit, shkencëtarët molekularë kanë zhvilluar procedura të ndryshme të standardizuara që lejojnë grumbullimin më të lehtë të fragmenteve të shumta të ADN-së në një pjesë të vetme. Prandaj, metodat e klonimit si Lidhja me Enzimën e Kufizimit, Klonimi i Gateway, Asambleja Gibson, Asambleja e Portës së Artë dhe Klonimi TOPO përdoren gjerësisht nga studiuesit në eksperimentet shkencore. Prandaj, Golden Gate dhe Gibson Assembly janë dy metoda të klonimit molekular që lejojnë grumbullimin e fragmenteve të shumta të ADN-së në një pjesë të vetme.
Çfarë është Kuvendi i Portës së Artë?
Golden Gate është një metodë klonimi molekular që lehtëson montimin e fragmenteve të shumta të ADN-së në një pjesë të vetme. Kjo metodë mbështetet në praninë e vendeve kufizuese brenda një sekuence të veçantë që do të klonohet. Filloi në vitin 1996. Kjo teknikë përdor enzimat kufizuese të tipit IIS dhe ligazën e ADN-së T4. Këto enzima prenë ADN-në jashtë vendeve të njohjes. Ato mund të krijojnë mbingarkesa jo palindromike. Prandaj, fragmente të shumta të ADN-së mund të mblidhen duke përdorur kombinime të sekuencave të mbingarkesës.
Figura 01: Porta e Artë
Procedura e montimit të Portës së Artë
Teknika Golden Gate ka tre hapat kryesorë në procedurën e saj:
- krijimi i mbingarkimeve në vektorin e klonimit,
- bashkim i inserteve të shumta të ADN-së duke përdorur sekuenca specifike të fragmenteve në mbingarkesa, dhe
- lidhje.
Asambleja Golden Gate përdor vektorë të klonimit rrethor (vektori i destinacionit). Për më tepër, në këtë metodë, vendi i kufizimit eliminohet nga produkti i lidhur me qëllim që të kryhet tretja dhe lidhja në të njëjtën kohë. Një protokoll tipik i ciklit termik për Golden Gate luhatet midis 37 °C dhe 16 °C sepse 37 °C është optimale për enzimat kufizuese dhe 16 °C është optimale për ligazat.
Çfarë është Asambleja Gibson?
Ambledhja Gibson është një metodë klonimi molekular që lejon grumbullimin e fragmenteve të shumta të ADN-së në një pjesë të vetme. Ndryshe nga metoda Golden Gate, kjo metodë nuk mbështetet në praninë e vendeve kufizuese brenda një sekuence të veçantë që do të klonohet. Ai u gjet nga Daniel G. Gibson i Institutit J. Craig Venter. Kjo teknikë është një lloj metode e klonimit të pavarur nga sekuenca dhe ligaza (SLIC).
Figura 02: Asambleja Gibson
Procedura e montimit të Gibson
Asambleja Gibson ka nevojë për fragmente të ADN-së që përmbajnë 20-40 çifte bazash që mbivendosen me fragmente të ADN-së ngjitur. Mbivendosjet shtohen nëpërmjet PCR. Pastaj këto fragmente të ADN-së i shtohen përzierjes Gibson maser që ka tre enzima. Kjo procedurë kryhet në kushte izotermike (50 °C për 1 orë) duke përdorur tre enzima të ndryshme: ekzonukleaza, ADN polimeraza dhe ADN ligaza. Eksonukleaza përtyp ADN-në nga fundi 5'. Kështu, ai nuk pengon aktivitetin e polimerazës dhe lejon që reagimi të vazhdojë në një proces të vetëm. Regjionet me një fije floku që rezultojnë në fragmentet ngjitur të ADN-së mund të pjekohen për shkak të sekuencave të mbivendosjes. ADN polimeraza mbush boshllëqet duke shtuar nukleotide. Së fundi, ligaza e ADN-së bashkohet në mënyrë kovalente me ADN-në e segmenteve ngjitur. Normalisht, Gibson Assembly përdor vektorë të destinacionit të linearizuar. Për më tepër, kjo metodë mund të kombinojë njëkohësisht deri në 15 fragmente të ADN-së bazuar në ngjashmërinë e sekuencës.
Ngjashmëritë midis Golden Gate dhe Asamblesë Gibson
- Golden Gate dhe Gibson Assembly janë dy metoda të klonimit molekular.
- Të dyja metodat mund të bashkojnë fragmente të shumta të ADN-së në një pjesë të vetme.
- Këto metoda përdorin vektorët e destinacionit.
- Të dyja metodat përdorin ciklues termik për montimin e fragmenteve të shumta të ADN-së.
- Ato përdoren në mutagjenezën e drejtuar nga vendi.
Dallimi midis Golden Gate dhe Asamblesë Gibson
Golden Gate është një metodë klonimi molekular e përdorur në montimin e fragmenteve të shumta të ADN-së në një pjesë të vetme duke u mbështetur në praninë e vendeve kufizuese brenda një sekuence të caktuar që do të klonohet, ndërsa Gibson Asambleja është një metodë klonimi molekular e përdorur në grumbullimi i fragmenteve të shumta të ADN-së në një pjesë të vetme pa u mbështetur në praninë e vendeve kufizuese brenda një sekuence të veçantë që do të klonohet. Ky është ndryshimi kryesor midis Golden Gate dhe Asamblesë Gibson. Për më tepër, metoda Golden Gate përdor një vektor rrethor të destinacionit, ndërsa metoda e Kuvendit Gibson përdor një vektor të linearizuar të destinacioneve.
Infografia e mëposhtme tregon ndryshimin midis Golden Gate dhe Gibson Assembly.
Përmbledhje – Golden Gate vs Gibson Assembly
Klonimi molekular është një metodë që përdoret për të mbledhur molekulat e ADN-së rekombinante dhe për të drejtuar replikimin e tyre brenda organizmave pritës. Golden Gate dhe Gibson Assembly janë dy metoda molekulare të klonimit që lejojnë grumbullimin e fragmenteve të shumta të ADN-së në një pjesë të vetme. Metoda e Golden Gate mbështetet në praninë e vendeve kufizuese brenda një sekuence të caktuar për t'u klonuar, ndërsa Gibson Asambleja nuk mbështetet në praninë e vendeve të kufizimit brenda një sekuence të veçantë për t'u klonuar. Kështu, ky është ndryshimi kryesor midis Golden Gate dhe Asamblesë Gibson.
