Dallimi kryesor – Tripsinizimi i ngrohtë kundër të ftohtë
Trypsinizimi i ngrohtë dhe i ftohtë janë dy metoda të përdorura në zbërthimin enzimatik të qelizave në kultivimin e qelizave shtazore. Dallimi kryesor midis tripsinizimit të ngrohtë dhe të ftohtë, siç sugjerojnë emrat, varet nga temperatura në të cilën shtohet tripsina për zbërthimin qelizor. Tripsinizimi i ngrohtë ndodh në kushte të temperaturës më të lartë (36,5 – 37 0C) ndërsa tripsinizimi i ftohtë ndodh në kushte me temperaturë të ulët.
Gjatë procesit të kultivimit primar qelizor të qelizave shtazore, janë përdorur tre metoda kryesore që kanë rezultuar të jenë të suksesshme. Të tre metodat përfshijnë zbërthimin mekanik të qelizave, zbërthimin enzimatik të qelizave dhe teknikën parësore të eksplantit. Shpërbërja enzimatike e qelizave që çon në izolimin e qelizave dhe bëhet nga enzima degraduese e proteinave, tripsina. Prandaj, ky proces njihet si Tripsinizimi. Tripsinizimi mund të bëhet në dy kushte të ndryshme, përkatësisht Tripsinizimi i ngrohtë dhe Tripsinizimi i Ftohtë. Tripsinizimi i ngrohtë është metoda e trajtimit të qelizave me tripsinë në kushte të ngrohta në një temperaturë prej 36,5 – 37 0C. Tripsinizimi i ftohtë është procesi i trajtimit të tripsinës që zhvillohet në kushte më të ftohta, mundësisht në akull duke mbajtur temperatura shumë të ulëta.
Çfarë është Tripsinizimi i ngrohtë?
Trypsinizimi mund të bëhet për të zbërthyer përbërësit qelizor në mënyrë që të izolohen qelizat për të prodhuar një kulturë primare qelizore. Tripsina është një enzimë e degradimit të proteinave dhe përzierja e enzimës e përdorur në tripsinizim mund të jetë ose një ekstrakt i papërpunuar ose një produkt i pastruar. Ekstrakti i papërpunuar thuhet se është më efikas në lizën e proteinave dhe shpërbërjen e qelizave pasi përmban enzima të tjera degraduese.
Tripsinizimi i ngrohtë është metoda enzimatike më e përdorur për zbërthimin e qelizave që ndodh në kushte të temperaturës më të lartë. Përpara trajtimit me tripsinizim, indi i dëshiruar pritet në copa më të vogla. Ai lehtëson procesin e lehtë të ndarjes. Indi i copëtuar më pas lahet në një medium special të njohur si mediumi i kripës bazale të diseksionit.
Me përfundimin e hapit të larjes, qelizat shndërrohen në një balonë që përmban enzimën aktive, e cila është tripsina. Meqenëse kjo teknikë nënkupton një protokoll të ngrohtë trypsinizimi, tripsina vendoset në një temperaturë prej rreth 37 0C për rreth katër orë.
Figura 01: Tripsina
Përmbajtja përzihet dhe trazohet duke përdorur metoda centrifugimi për lehtësimin e protokollit dhe për të shpejtuar procesin e ndarjes. Pasi të arrihet koha e rekomanduar, qelizat mund të rrjedhin nga supernatanti. Qelizat që rrjedhin nga supernatanti më pas inkubohen në një temperaturë dhe kohë të caktuar.
Çfarë është Tripsinizimi i Ftohtë?
Tripsinizimi i ftohtë është lloji tjetër i tripsinizimit që ndodh në kushte të ftohta. Në këtë teknikë, qelizat që copëtohen dhe lahen vendosen në shishka mbi akull dhe më pas njomet me tripsinë. Periudha e njomjes është shumë më e gjatë - rreth 6 - 24 orë.
Pas përfundimit të procedurës së njomjes, tripsina hiqet nga lizati i qelizave dhe pjesët e indeve inkubohen më tej në 37 0C për rreth 20-30 minuta. Zbërthimi i qelizave shkaktohet nga pipetimi i përsëritur i përzierjes së indeve. Kjo do të lejojë qelizat të shkëputen nga membrana dhe të vijnë në supernatant. Pasi qelizat janë në supernatant, ato inkubohen dhe rriten në një temperaturë dhe periudhë kohore të dëshiruar.
Metoda e tripsinizimit të ftohtë ka disa përparësi
- Rendiment më i lartë i qelizave të qëndrueshme pasi dëmtimi i qelizave minimizohet. Dëmtimi i qelizave minimizohet duke mos përdorur hapat e centrifugimit.
- Metodë shumë e përshtatshme.
- Më pak e mundimshme.
Kufizimi kryesor i metodës së tripsinizimit të ftohtë është se sasitë e mëdha nuk mund të përdoren në një rast.
Cilat janë ngjashmëritë midis tripsinizimit të ngrohtë dhe të ftohtë?
- Të dy proceset e tripsinizimit të ngrohtë dhe të ftohtë përdorin enzimën tripsinë për zbërthimin e qelizave.
- Të dy proceset e tripsinizimit të ngrohtë dhe të ftohtë përdoren në procedurat e kulturës qelizore për zbërthimin e qelizave.
- Në të dyja procedurat e trajtimit të tripsinizimit të ngrohtë dhe të ftohtë, qelizat rrjedhin nga supernatanti.
Cili është ndryshimi midis tripsinizimit të ngrohtë dhe të ftohtë?
Tripsinizimi i ngrohtë kundër të ftohtë |
|
| Tripsinizimi i ngrohtë është metoda e trajtimit të qelizave me tripsinë në kushte të ngrohta në një temperaturë prej 36,5 – 37 0. | Tripsinizimi i ftohtë është procesi i trajtimit të tripsinës që zhvillohet në kushte më të ftohta, mundësisht në akull duke ruajtur temperatura shumë të ulëta. |
| Protokolli | |
| Copat e indeve të copëtuara mbahen në 37 0C vazhdimisht gjatë gjithë procedurës. | Copat e indeve të copëtuara fillimisht mbahen në temperatura të ftohta akulli dhe më pas mbahen në 37 0. |
| Temperatura | |
| Tripsinizimi i ngrohtë ndodh në 36,5 – 37 0 | Tripsinizimi i ftohtë ndodh në temperatura të ftohta me akull. |
| Koha e konsumuar | |
| Kërkohet më pak kohë për të gjithë procesin (rreth 4 orë) të trypsinizimit të ngrohtë. | Kërkohet kohë më e gjatë (rreth 6 – 24 orë) për tripsinizimin e ftohtë. |
| Rendimenti i qelizave të qëndrueshme | |
| Tripsinizimi i ulët i ngrohtë. | Tripsinizimi i lartë në të ftohtë. |
| Përdorimi i centrifugimit | |
| Centrifugimi kërkohet për zbërthimin e qelizave në tripsinizimin e ngrohtë. | Centrifugimi nuk kërkohet në tripsinizimin e ftohtë. |
| Sasia fillestare e indit për tripsinizimin | |
| Një sasi më e madhe indi mund të përdoret në trypsinizimin e ngrohtë. | Një sasi më e vogël indi mund të përdoret në tripsinizimin e ftohtë. |
| Dëmtimi i qelizave | |
| I lartë për shkak të centrifugimit në trypsinizimin e ngrohtë. | Më pak për shkak të tripsinizimit të ftohtë. |
Përmbledhje – Tripsinizimi i ngrohtë kundër të ftohtë
Trypsinizimi është metoda e përdorimit të enzimës së degradimit të proteinave, tripsinës, për zbërthimin dhe përgatitjen e kulturave primare të qelizave gjatë procesit të kultivimit të qelizave. Ekzistojnë dy teknika kryesore të tripsinizimit bazuar në temperaturat e përdorura gjatë procedurës. Janë tripsinizim të ngrohtë dhe të ftohtë. Tripsinizimi i ngrohtë kryhet në 37 0C ndërsa tripsinizimi i ftohtë kryhet në kushte të ftohta akulli. Megjithëse tripsinizimi i ftohtë kërkon më shumë kohë për të përfunduar, thuhet se ka një rendiment më të lartë të qelizave të qëndrueshme. Kjo për faktin se dëmtimi i qelizave minimizohet në tripsinizimin e ftohtë pasi nuk përdor hapa të fuqishëm centrifugimi. Ky është ndryshimi midis tripsinizimit të ngrohtë dhe të ftohtë.
