Dallimi kryesor – Sekuenca Sanger vs Pyrosequencing
Sekuenca e ADN-së është shumë e rëndësishme për analizën e ADN-së pasi njohja e rregullimit të saktë të nukleotideve në një rajon të caktuar të ADN-së zbulon shumë informacione të rëndësishme për të. Ekzistojnë metoda të ndryshme të sekuencës së ADN-së. Sekuenca Sanger dhe Pyrosequencing janë dy metoda të ndryshme të sekuencës së ADN-së të përdorura gjerësisht në Biologjinë Molekulare. Dallimi kryesor midis sekuencës Sanger dhe Pyrosequencing është se sekuenca Sanger përdor dideoksinukleotide për të përfunduar sintezën e ADN-së për të lexuar sekuencën nukleotide ndërsa pirosekuenca zbulon lirimin e pirofosfatit duke përfshirë nukleotidet dhe duke sintetizuar rendin plotësues të sekuencës së saktë për të lexuar.
Çfarë është Sekuenca Sanger?
Sanger sekuenca është një metodë e gjeneratës së parë të renditjes së ADN-së e zhvilluar nga Frederick Sanger dhe kolegjet e tij në 1977. Njihet gjithashtu si Sekuenca e Përfundimit të Zinxhirit ose Sekuenca Dideoksi pasi bazohet në përfundimin e zinxhirit nga dideoksinukleotidet (ddNTPs). Kjo metodë u përdor gjerësisht për më shumë se 30 vjet derisa u zhvillua Sekuenca e Gjeneratës së Re (NGS). Teknika e sekuencës Sanger mundësoi zbulimin e rendit të saktë të nukleotideve ose lidhjen e një fragmenti të veçantë të ADN-së. Ai bazohet në inkorporimin selektiv të ddNTP-ve dhe përfundimin e sintezës së ADN-së gjatë replikimit in vitro të ADN-së. Mungesa e grupeve 3' OH për të vazhduar formimin e lidhjes fosfodiesterike midis nukleotideve ngjitur është një tipar unik i ddNTPs. Prandaj, pasi ddNTP është ngjitur, zgjatja e zinxhirit pushon dhe përfundon nga ajo pikë. Ekzistojnë katër ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP dhe ddTTP - të përdorura në sekuencën Sanger. Këto nukleotide ndalojnë procesin e riprodhimit të ADN-së kur ato inkorporohen në vargun në rritje të ADN-së dhe rezultojnë në gjatësi të ndryshme të ADN-së së shkurtër. Elektroforeza e xhelit kapilar përdoret për të organizuar këto vargje të shkurtra të ADN-së sipas madhësive të tyre në një xhel siç tregohet në figurën 01.
Figura 1: Elektroforeza e xhelit kapilar të ADN-së së shkurtër të sintetizuar
Për replikimin in vitro të ADN-së, duhet të sigurohen pak kërkesa. Ato janë enzima e polimerazës së ADN-së, ADN-ja e shabllonit, primerët e oligonukleotideve dhe deoksinukleotidet (dNTP). Në sekuencën Sanger, riprodhimi i ADN-së kryhet në katër epruveta të veçanta së bashku me katër lloje të ddNTP-ve veçmas. Deoksinukleotidet nuk zëvendësohen plotësisht nga ddNTP-të përkatëse. Një përzierje e dNTP-së së veçantë (për shembull; dATP + ddATP) përfshihet në tub dhe përsëritet. Katër produkte të veçanta të tubave përdoren në një xhel në katër puse të veçanta. Më pas, duke lexuar xhelin, sekuenca mund të ndërtohet siç tregohet në Figurën 02.
Figura 02: Sekuenca Sanger
Sekuenca e Sanger është një teknikë e rëndësishme që ndihmon në shumë fusha të biologjisë molekulare. Projekti i gjenomit njerëzor u përfundua me sukses me ndihmën e metodave të bazuara në sekuencën e Sanger. Sekuenca e Sanger është gjithashtu e dobishme në sekuencën e synuar të ADN-së, kërkimin e kancerit dhe sëmundjeve gjenetike, analizën e shprehjes së gjeneve, identifikimin e njeriut, zbulimin e patogjenit, sekuencën mikrobiale etj.
Ka disa disavantazhe të renditjes së Sanger:
- Gjatësia e ADN-së që renditet nuk mund të jetë më e gjatë se 1000 çifte bazash
- Vetëm një varg mund të renditet në të njëjtën kohë.
- Procesi kërkon kohë dhe i kushtueshëm.
Prandaj, me kalimin e kohës u zhvilluan teknika të reja të avancuara të renditjes për të kapërcyer këto probleme. Megjithatë, sekuenca Sanger është ende në përdorim për shkak të rezultateve shumë të sakta deri në afërsisht 850 fragmente të gjatësisë së çifteve bazë.
Çfarë është Pyrosequencing?
Pyrosekuenca është një teknikë e re e sekuencës së ADN-së e bazuar në "sekuencën me sintezë". Kjo teknikë mbështetet në zbulimin e lirimit të pirofosfatit në inkorporimin e nukleotideve. Procesi përdoret nga katër enzima të ndryshme: polimera e ADN-së, ATP sulfurilaza, luciferaza dhe apiraza dhe dy substrate adenozina 5' fosfosulfat (APS) dhe luciferina.
Procesi fillon me lidhjen e primerit me shabllonin e ADN-së me një zinxhir dhe ADN polimeraza fillon inkorporimin e nukleotideve plotësuese të tij. Kur nukleotidet bashkohen (polimerizimi i acidit nukleik), ai lëshon grupe pirofosfate (dy grupe fosfate të lidhura së bashku) dhe energji. Çdo shtim nukleotidi lëshon sasi ekuimolare të pirofosfatit. Pirofosfati shndërrohet në ATP nga ATP sulfurilaza në prani të substratit APS. ATP-ja e gjeneruar drejton konvertimin e luciferinës në oksiluciferinë të ndërmjetësuar nga luciferaza, duke prodhuar dritë të dukshme në sasi që janë proporcionale me sasinë e ATP-ve. Drita zbulohet nga një pajisje për zbulimin e fotonit ose nga fotoshumëzimi dhe krijon një pirogram. Apiraza degradon ATP dhe dNTP-të jo të inkorporuara në përzierjen e reaksionit. Shtimi dNTP bëhet një herë në një kohë. Meqenëse shtimi i nukleotidit është i njohur sipas inkorporimit dhe zbulimit të dritës, sekuenca e shabllonit mund të përcaktohet. Pirogrami përdoret për gjenerimin e sekuencës nukleotide të mostrës së ADN-së siç tregohet në figurën 03.
Pyrosekuenca është shumë e rëndësishme në analizën e polimorfizmit të vetëm nukleotideve dhe renditjen e shtrirjeve të shkurtra të ADN-së. Saktësia e lartë, fleksibiliteti, lehtësia e automatizimit dhe përpunimi paralel janë avantazhet e pirosekuencës mbi teknikat e renditjes Sanger.
Figura 03: Pyrosekuenca
Cili është ndryshimi midis Sekuencës Sanger dhe Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger sekuenca është një metodë e sekuencës së ADN-së e bazuar në përfshirjen selektive të ddNTP-ve nga ADN polimeraza dhe përfundimi i zinxhirit. | Pyrosekuenca është një metodë e sekuencës së ADN-së e bazuar në zbulimin e çlirimit të pirofosfatit pas përfshirjes së nukleotidit. |
| Përdorimi i ddNTP | |
| ddNTP përdoren për të përfunduar replikimin e ADN-së | ddNTP nuk janë përdorur. |
| Enzimat e përfshira | |
| Përdoret polimeraza e ADN-së. | Përdoren katër enzima: ADN polimeraza, ATP sulfurilaza, Luciferaza dhe Apiraza. |
| Substrate të përdorura | |
| APS dhe Luciferin nuk përdoren. | Përdoren Adenozinë 5' fosfosulfat (APS) dhe luciferin. |
| Temperatura maksimale | |
| Ky është një proces i ngad altë. | Ky është një proces i shpejtë. |
Përmbledhje – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger sekuenca dhe Pyrosequencing janë dy metoda të sekuencës së ADN-së të përdorura në biologjinë molekulare. Sekuenca Sanger ndërton rendin e nukleotideve në sekuencë duke përfunduar zgjatjen e zinxhirit ndërsa pirosekuenca ndërton rendin e saktë të nukleotideve në sekuencë duke përfshirë nukleotide dhe duke zbuluar lirimin e pirofosfateve. Prandaj, ndryshimi kryesor midis sekuencës Sanger dhe Pyrosequencing është se sekuenca Sanger punon në sekuencën duke përfunduar zinxhir ndërsa pirosekuenca punon në sekuencën me sintezë.
