Dallimi kryesor – Maxam Gilbert vs Sekuenca Sanger
Nukleotidet janë njësitë bazë strukturore dhe blloqet ndërtuese të ADN-së. Molekula e ADN-së përbëhet nga një zinxhir polinukleotid. Në ADN gjenden katër nukleotide të ndryshme. Këto nukleotide përbëhen nga katër baza të ndryshme azotike të quajtura A (adeninë), G (guaninë), C (citozinë), T (timinë). Rendi i nukleotideve në molekulën e ADN-së ka një rëndësi të madhe pasi kodon një informacion të rëndësishëm gjenetik për rritjen dhe zhvillimin e organizmave. Sekuenca e ADN-së i referohet procesit që përcakton sekuencën e saktë të nukleotideve të ADN-së. Ekzistojnë metoda të ndryshme të sekuencës së ADN-së. Sekuenca e Maxam Gilbert dhe sekuenca e ADN-së Sanger janë dy metoda të sekuencës së ADN-së që i përkasin sekuencës së gjeneratës së parë. Procedura e sekuencës së Maxam Gilbert përcakton sekuencën bazë duke copëtuar kimikisht fragmentet e ADN-së të etiketuara në fund 5' në mënyrë preferenciale në secilin prej katër nukleotideve dhe elektroforezës me xhel. Procedura e sekuencës Sanger përcakton sekuencën nukleotidike duke sintetizuar ADN-në me një fije floku duke përdorur ADN polimerazë dhe didoksinukleotide dhe elektroforezë me xhel. Ky është ndryshimi kryesor midis Maxam Gilbert dhe Sanger Sequencing.
Çfarë është Maxam Gilbert Sequencing?
Sekuenca e Maxam Gilbert, e njohur gjithashtu si metoda e renditjes kimike, është një teknikë e cila u zhvillua për të përcaktuar rendin e nukleotideve në ADN. Kjo metodë u prezantua nga W alter Gilbert dhe Alan Maxam në 1976 dhe u bë e njohur pasi mund të kryhet drejtpërdrejt me ADN të pastruar. Metoda Maxam Gilbert i përket gjeneratës së parë të sekuencës së ADN-së dhe ishte metoda e parë e sekuencës e përdorur gjerësisht nga shkencëtarët.
Parimi bazë i kësaj metode qëndron në kufizimin e fragmenteve të ADN-së të etiketuara në fund në baza specifike nga kimikate dhe kushte specifike të bazës dhe ndarja e fragmenteve të etiketuara me elektroforezë siç tregohet në figurën 01. Fragmentet ndahen sipas në madhësitë e tyre në xhel. Meqenëse fragmentet janë të etiketuara, sekuenca e molekulës së ADN-së mund të konkludohet lehtësisht.
Metoda Maxam Gilbert përdor kimikate specifike bazë për të thyer ADN-në në baza specifike. Dy kimikate të zakonshme të quajtura kimikate dimetil sulfat dhe hidrazinë përdoren për të sulmuar në mënyrë selektive respektivisht purinat dhe pirimidinat.
Metoda e renditjes së Maxam Gilbert kryhet nëpërmjet disa hapave si më poshtë.
- Pastrimi i sekuencës së ADN-së duke përdorur endonukleaza restriktiv
- Etiketimi i skajeve të fragmenteve të ADN-së duke shtuar fosfate radioaktive
- Pastrimi i fragmenteve të etiketuara nga fragmentet e paetiketuara me elektroforezë me xhel
- Ndarja e ADN-së së etiketuar në fund në katër tuba dhe trajtimi me kimikate specifike bazë veçmas
- Elektroforeza e përmbajtjes së çdo tubi në vija të veçanta në një xhel dhe ndarja e fragmenteve sipas gjatësisë së tyre.
- Zbulimi i fragmenteve me autoradiograf.
Figura 01: Renditja e Maxam Gilbert
Çfarë është Sekuenca Sanger?
Sanger Sequencing është një metodë renditjeje e zhvilluar nga Frederick Sanger dhe kolegët e tij në 1977 për të përcaktuar sekuencën bazë të një fragmenti të caktuar të ADN-së. Njihet gjithashtu si sekuenca e përfundimit të zinxhirit ose metoda e sekuencës Dideoksi. Kjo metodë funksionon në parimin e inkorporimit selektiv të dideoksinukleotideve që përfundojnë zinxhirin (ddNTPs) si ddGTP, ddCTP, ddATP dhe ddTTP nga ADN polimeraza gjatë sintezës së ADN-së me një zinxhir për të përfunduar formimin e vargut. Dideoksinukleotideve u mungojnë grupet 3’ OH për formimin e lidhjeve fosfodiesterike me nukleotidet fqinje. Prandaj, formimi i vargut ndalon sapo një ddNTP të përfshihet në vargun e sapoformuar gjatë renditjes së sangerit.
Në këtë metodë, katër reaksione të veçanta të sintezës së ADN-së (PCR) kryhen në katër tuba të veçantë me një lloj ddNTP. Kërkesa të tjera ofrohen edhe për tubat për PCR duke përfshirë primerët, dNTPs, Taq polimerazën, kushte specifike, etj. Katër reaksione të veçanta kryhen në katër tuba me katër përzierje. Pas reaksioneve PCR, fragmentet e ADN-së që rezultojnë denatyrohen nga nxehtësia dhe ndahen me elektroforezë xhel. Pastaj fragmentet vizualizohen duke përdorur ose një primer të etiketuar (radioaktive ose fluoreshente) ose dNTP siç tregohet në figurën 02.
Figura 02: Sekuenca Sanger
Cili është ndryshimi midis Maxam Gilbert dhe Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Sekuenca e Maxam Gilbert është teknika e parë e zhvilluar për renditjen e ADN-së. | Metoda e sekuencës Sanger u prezantua pas metodës së renditjes së renditjes Maxam Gilbert. |
| Përdorimi | |
| Kjo metodë përdoret rrallë. | Sekuenca e Sanger përdoret në mënyrë rutinore për renditjen. |
| Përdorimi i kimikateve të rrezikshme | |
| Përdor kimikate të rrezikshme. | Përdorimi i kimikateve të rrezikshme është i kufizuar në krahasim me metodën Maxam Gilbert. |
| Etiketimi për zbulimin | |
| Kjo metodë përdor P32 për etiketimin e skajeve të fragmenteve të ADN-së. | Sekuenca Sanger përdor ddNTP të etiketuara në mënyrë radioaktive ose fluoreshente. |
Përmbledhje – Maxam Gilbert vs Sekuenca Sanger
Sekuenca e Maxam Gilbert dhe Sanger janë dy lloje të teknikave të sekuencimit të ADN-së që vijnë nën renditjen e ADN-së të gjeneratës së parë. Sekuenca e Maxam Gilbert është metoda e parë e prezantuar për renditjen e ADN-së në vitin 1976, dhe kryhet duke thyer fragmentet e etiketuara të ADN-së në fund me kimikate specifike të bazës. Prandaj, njihet si sekuenca kimike. Metoda e sekuencës Sanger u prezantua në vitin 1977 dhe bazohet në reaksionet e përfundimit të zinxhirit të drejtuar nga ddNTP. Metoda e sekuencës Sanger është e popullarizuar se metoda Maxam Gilbert për shkak të disavantazheve të metodës Maxam Gilbert si konsumi i tepërt i kohës, përdorimi i kimikateve të rrezikshme, etj. Ky është ndryshimi midis renditjes së Maxam Gilbert dhe Sanger.
