Dallimi kryesor – PCR kundrejt sekuencës së ADN-së
PCR dhe sekuenca e ADN-së janë dy teknika të rëndësishme në Biologjinë Molekulare. Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) është procesi që krijon një numër të madh kopjesh të një fragmenti të ADN-së. Sekuenca e ADN-së është teknika që rezulton në rendin e saktë të nukleotideve të një fragmenti të caktuar të ADN-së. Ky është ndryshimi kryesor midis sekuencës PCR dhe ADN-së. PCR është një nga hapat kryesorë të përfshirë në sekuencën e ADN-së.
Çfarë është PCR?
Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) është një teknikë e amplifikimit të ADN-së e përdorur në Biologjinë Molekulare. Ai prodhon mijëra deri në miliona kopje të një fragmenti të veçantë të ADN-së. Kjo metodë u zhvillua nga Kary Mullis në 1983. Në këtë teknikë, fragmenti i ADN-së që do të përforcohet shërben si shabllon dhe enzima e ADN polimerazës shton nukleotide plotësuese në primerin i cili është i disponueshëm në përzierjen PCR. Në fund të reaksionit PCR, sintetizohen shumë kopje të mostrës së ADN-së.
Ekzistojnë përbërës të ndryshëm të përzierjes PCR, duke përfshirë ADN-në, ADN-polimerazën (Taq polimeraza), primerët (primera përpara dhe të kundërt), nukleotide (blloqe ndërtuese të ADN-së) dhe një tampon. PCR ndodh brenda një makinerie PCR dhe përzierja e saktë PCR duhet të ngarkohet në makinë dhe duhet të drejtohet programi i duhur. Kjo teknikë mundëson prodhimin e mijëra deri në miliona kopjeve të një seksioni të caktuar të ADN-së nga një sasi shumë e vogël e ADN-së.
Reaksionet PCR ndodhin në një mënyrë ciklike për të prodhuar sasinë e dukshme të produkteve PCR në një xhel. Ekzistojnë tre hapa kryesorë të përfshirë në një reaksion PCR, domethënë denatyrimi, pjekja e primerit dhe shtrirja e vargut siç tregohet në Figurën 01. Këto tre hapa po ndodhin në tre temperatura të ndryshme. ADN-ja ekziston në formë të dyfishtë nga lidhjet hidrogjenore midis bazave plotësuese. Përpara implikimit, ADN-ja me dy vargje duhet të ndahet nga njëra-tjetra. Bëhet duke dhënë temperaturë të lartë. Në një temperaturë të lartë, ADN-ja dyvargëshe denatyrohet në fije të vetme. Pastaj primerët duhet të afrohen më afër skajeve anësore të fragmentit specifik ose gjenit të ADN-së. Primer është një pjesë e shkurtër e ADN-së me një fije floku që është komplementare me sekuencën e synuar. Primerët e përparmë dhe të kundërt kalojnë me bazat plotësuese në skajet anësore të ADN-së së mostrës së denatyruar në temperaturën e pjekjes. Primerët duhet të jenë rezistent ndaj nxehtësisë. Pasi primerët pjekjen me mostrën e ADN-së, enzima taq polimeraza fillon sintezën e vargjeve të reja duke shtuar nukleotide që janë plotësuese me ADN-në e synuar. Taq polimeraza është një enzimë e qëndrueshme ndaj nxehtësisë e izoluar nga një bakter termofilik i quajtur Thermus aquaticus. Buferi PCR ruan kushtet optimale për veprimin e polimerazës taq. Këto tre faza të reaksioneve PCR përsëriten për të prodhuar sasinë e kërkuar të produktit PCR. Pas çdo reaksioni PCR, numri i kopjes së ADN-së dyfishohet. Prandaj, një përforcim eksponencial mund të vërehet në PCR. Produktet PCR mund të vëzhgohen duke përdorur elektroforezë me xhel dhe mund të pastrohen për studime të mëtejshme.
Figura 01: Hapat kryesorë të një reagimi PCR
PCR është një mjet i vlefshëm në kërkimet mjekësore dhe biologjike. PCR ka një vlerë të veçantë në shkencën mjekoligjore pasi mund të amplifikojë ADN-në për studime nga mostrat e vogla të kriminelëve dhe të bëjë profile të ADN-së mjeko-ligjore. PCR përdoret gjerësisht në shumë fusha të biologjisë molekulare, duke përfshirë, gjenotipizimin, klonimin e gjeneve, zbulimin e mutacioneve, sekuencën e ADN-së, mikrovargjet e ADN-së dhe testimin e atësisë, etj.
Figura 02: Reaksioni zinxhir i polimerazës
Çfarë është Sekuenca e ADN-së?
Sekuenca e ADN-së është përcaktimi i një rendi të saktë të nukleotideve - adeninë, guaninë, citozinë dhe timinë në një fragment të caktuar të ADN-së. Informacioni gjenetik ruhet në sekuencat e ADN-së duke përdorur rendin e saktë të nukleotideve. Prandaj, gjetja e rendit të saktë të nukleotideve në një fragment të ADN-së është shumë e rëndësishme për të ditur për strukturën dhe funksionin e gjeneve.
Protokolli i sekuencës së ADN-së përfshin procese të ndryshme. Hapi i parë është izolimi i ADN-së së interesuar ose ADN-së gjenomike të një organizmi. Duke përdorur PCR (siç përshkruhet më sipër), zona e dëshiruar e ADN-së duhet të përforcohet. Produkti i amplifikuar PCR duhet të ndahet me elektroforezë me xhel dhe të pastrohet. Fragmentet e përforcuara shërbehen si shabllone për renditje. Sekuenca mund të bëhet ose duke ndjekur sekuencën e Sanger ose metodën e sekuencës së xhiros së lartë. Sekuenca e Sanger kërkon elektroforezë kapilare të fragmenteve të ADN-së që rezultojnë. Përcaktimi i rendit të saktë të nukleotideve mund të bëhet me leximin manual të autoradiografëve ose duke përdorur sekuencues të automatizuar të ADN-së.
Sekuenca e gjeneve kontribuoi në projektin e gjenomit njerëzor dhe lehtësoi hartëzimin e gjenomit njerëzor në 2003. Në mjekësi ligjore, sekuenca e ADN-së mundësoi identifikimin e individëve që tregojnë sekuenca unike të ADN-së dhe identifikojnë kriminelët. Në mjekësi, sekuenca e ADN-së mund të përdoret për të zbuluar gjenet përgjegjëse për sëmundjet gjenetike dhe sëmundje të tjera, për të gjetur gjenet e defektit dhe për t'i zëvendësuar ato me gjene të sakta. Në bujqësi, informacioni i sekuencës së ADN-së të disa mikroorganizmave përdoret për të prodhuar kultura transgjenike me karakteristika të dëshiruara ekonomikisht.
Figura 03: Sekuenca e ADN-së
Cili është ndryshimi midis PCR dhe sekuencës së ADN-së?
PCR vs Sekuenca e ADN-së |
|
| Procesi PCR krijon mijëra deri në miliona kopje të fragmentit të interesuar të ADN-së. | Sekuenca e ADN-së është procesi i përcaktimit të rendit të saktë të nukleotideve në një fragment të caktuar të ADN-së. |
| Rezultati | |
| PCR krijon mijëra deri në miliona kopje të një fragmenti të veçantë të ADN-së | Kjo rezulton në rendin e saktë të bazave në një fragment të veçantë të ADN-së. |
| Përfshirja e ddNTPs | |
| PCR nuk kërkon ddNTP. Ai përdor dNTP. | Sekuenca e ADN-së kërkon ddNTP për të përfunduar formimin e vargut. |
Përmbledhje – PCR vs Sekuenca e ADN-së
PCR dhe sekuenca e ADN-së janë mjete shumë të rëndësishme në shumë fusha të Biologjisë Molekulare. Amplifikimi i fragmenteve të ADN-së bëhet me teknikën PCR ndërsa rendi i saktë i nukleotideve të një fragmenti të ADN-së përcaktohet nga sekuenca e ADN-së. Ky është ndryshimi midis PCR dhe sekuencës së ADN-së.
