Dallimi kryesor – Primerët PCR vs Primerët e Sekuencës
Me zhvillimet e fundit në fushën e biologjisë molekulare, u zhvilluan teknika të ndryshme gjenetike që i bënë të lehta dhe të sakta proceset e hetimit të rrugëve të ndryshme të temës. PCR dhe procedurat e tjera të sekuencës janë dy teknika të tilla të rëndësishme. Ata përdorin nënkomponentë të ndryshëm. Primerët konsiderohen si nën-komponenti kryesor i përbashkët si për teknikat PCR ashtu edhe për Sekuencën. Primerët PCR përdoren për amplifikimin e një sekuence të veçantë të ADN-së, ndërsa primerët e sekuencës përdoren në kontekstin e sekuencës së një fragmenti të ADN-së me synimin për të zbuluar rendin e tij specifik të sekuencës nukleotide. Ky është ndryshimi kryesor midis primerëve PCR dhe primerëve të sekuencës.
Çfarë janë PCR Primers?
Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) është një teknikë gjenetike që përdoret në fushën e biologjisë molekulare për të amplifikuar një ose disa kopje të një segmenti të caktuar të ADN-së dhe për të marrë shumë miliona kopje identike. Në një reaksion PCR, përdoren përbërës të ndryshëm duke përfshirë primerët. Primerët janë vargje të shkurtra të ADN-së me një gjatësi nukleotide 18-25 duke i bërë ato të pajtueshme me rajonin e fillimit dhe të fundit të fragmenteve të ADN-së që do të amplifikohen. Primerët mund të jenë një primer përpara dhe abetare e kundërt. Këta abetare lidhen me fragmentin e ADN-së në pikat specifike ku bën që ADN polimeraza të lidhet me primerin specifik në vendndodhje dhe të inicojë sintezën e vargut të ri të ADN-së.
Përzgjedhja e primerëve është një aspekt i rëndësishëm i procesit të PCR. Zgjedhja e gjatësisë së abetares është e rëndësishme. Gjatësia ideale do të ishte 18-25 nukleotide. Nëse gjatësia është shumë e shkurtër ose shumë e gjatë, primerët nuk do të lidhen me sekuencën e ADN-së për t'u përforcuar me saktësi. Primerët që janë shumë të shkurtër në gjatësi çojnë në pjekjen jospecifike të primerit në vende të ndryshme të sekuencës së ADN-së.
Figura 01: Primerat PCR
Përmbajtja e Guaninës dhe Citozinës (GC) në një primer të mirë duhet të jetë në intervalin 40-60. Temperatura e pjekjes së primerit dhe temperatura e shkrirjes janë faktorë jetik gjatë PCR. Temperatura e shkrirjes duhet të llogaritet me saktësi dhe temperatura e pjekjes së primerit duhet të jetë 5 0C më pak se temperatura e shkrirjes. Temperatura e shkrirjes duhet të jetë 60 °C dhe 75 °C. Temperaturat shumë të larta ose shumë të ulëta do të rezultojnë në aktivitet më pak aktiv të polimerazës së ADN-së.
Çfarë janë abetaret e renditjes?
Abetaret e sekuencës përdoren në kontekstin e sekuencimit të një fragmenti të ADN-së me synimin për të zbuluar identitetin e tij specifik. Për të marrë rezultate të mira të renditjes janë të rëndësishme primerët dhe shabllonet me cilësi të lartë. Kështu, kur zgjidhen primerët, ato duhet të jenë unike për një rajon të caktuar ku dëshirojmë të renditim. Gjithashtu duhet të jetë me një orientim të saktë ku sekuencat zakonisht gjenerohen nga skajet 3' deri në 5' të abetareve. Sekuencës duhet t'i mungojë vetë-hibridizimi i padëshirueshëm, si p.sh. formimi i sytheve të kapëses së flokëve. Nuk duhet të përmbajë formime të njëpasnjëshme të bazave të Guaninës.
Temperatura e shkrirjes (Tm) e primerit duhet të jetë e përshtatshme për kushtet e renditjes. Prandaj, duhet të shtrihet midis 52oC dhe 74oC. Përgatitja e oligonukleotideve për t'u përdorur si primer duhet të pastrohet për të marrë gjatësinë e plotë të kërkuar të sekuencës. Nëse oligonukleotidet përmbajnë papastërti, sinjalizimi i sekuencës së primerit do të mbivendoset nga vende të ndryshme priming, dhe gjithashtu do të zvogëlojë numrin e qelizave bazë.
Figura 02: Abetarja e renditjes
Temperatura e shkrirjes së primerit (Tm) e një oligonukleotidi përcakton se sa të fortë janë fijet e ADN-së plotësuese të hibridizuara me njëra-tjetrën. Tm mund të konsiderohet si një llogaritje termodinamike ku varet nga të dy sekuencat e ADN-së dhe nga disa kushte si përqendrimi i kripës. Tm është i rëndësishëm gjatë PCR ku një variant i quajtur sekuenca e ciklit përdoret për të prodhuar një grup fragmentesh të përfunduara nga dideoksinukleotidi. Këtu, primeri që sekuencohet fillimisht do të kalohet në mënyrë alternative, më pas do të zgjerohet dhe së fundi do të denatyrohet për përforcim. Prandaj, vlera Tm duhet të jetë ndërmjet 52oC dhe 74o C. Oligonukleotidet e sintetizuara mund të merren nga laboratorët e sintezës së ADN/ARN-së sipas zgjedhje. Shkalla e vogël e sintezës që përdoret për renditjen e ADN-së është zakonisht 50 nmol. Gjithashtu, më e rëndësishmja, primerët e përdorur për sekuencë duhet të pastrohen që të jenë pa papastërti që do të parandalojnë uljen e cilësisë.
Cilat janë ngjashmëritë midis primerëve PCR dhe primerëve të sekuencës?
- Të dy Primerët PCR dhe Primerët e Sekuencës janë primerë që përdoren në procesin e amplifikimit të një sekuence të synuar të ADN-së.
- Të dy primerët PCR dhe Primerët e Sekuencës përbëhen nga nukleotide.
- Të dy primerët PCR dhe primerët e sekuencës janë oligomerë të shkurtër.
Cili është ndryshimi midis primerëve PCR dhe primerëve të sekuencës?
PCR Primers vs Primerët e Sekuencës |
|
| PCR janë vargje të shkurtra të ADN-së me një gjatësi të sekuencës nukleotide 18-25 duke i bërë ato të pajtueshme me rajonin e fillimit dhe të fundit të fragmenteve të ADN-së që do të përforcohen. | Abetrat e renditjes janë oligomerë të shkurtër që përdoren në kontekstin e renditjes së një fragmenti të ADN-së me synimin për të zbuluar identitetin e tij specifik. |
| Funksioni | |
| Abetaret PCR përdoren për amplifikimin e një sekuence të veçantë të ADN-së. | Abetaret e sekuencimit përdoren në kontekstin e sekuencimit të një fragmenti të ADN-së me synimin për të zbuluar identitetin e tij specifik. |
| Numri i abetareve të nevojshme | |
| Dy abetare; një primer përpara dhe një primer i kundërt përdoren si primerë PCR. | Nevojë vetëm një abetare si abetare e renditjes. |
Përmbledhje – Primerët PCR vs Primerët e Sekuencës
Abetaret e sekuencës përdoren në kontekstin e sekuencimit të një fragmenti të ADN-së me synimin për të zbuluar identitetin e tij specifik. Një abetare e renditjes do të jetë e mjaftueshme për të kryer procesin. Për të marrë rezultate të mira të renditjes, primerët dhe shabllonet me cilësi të lartë janë të rëndësishme. Kështu, kur zgjidhen primerët, ato duhet të jenë unike për një rajon të caktuar ku dëshirojmë të renditim. Primerët PCR janë vargje të shkurtra të ADN-së me një gjatësi nukleotide 18-25 e cila është e pajtueshme me rajonin e fillimit dhe të fundit të fragmenteve të ADN-së që do të amplifikohen. Primerët PCR mund të jenë një primer përpara dhe primer i kundërt. Përmbajtja e Guaninës dhe Citozinës (GC) në një primer të mirë duhet të jetë në intervalin 40-60. Temperatura e pjekjes së primerit dhe temperatura e shkrirjes janë aspekte jetike gjatë PCR. Ky është ndryshimi midis primerëve PCR dhe primerëve të sekuencës.
