Dallimi kryesor – Njohja veriore vs jugore kundër perëndimore
Zbulimi i sekuencave specifike të ADN-së, ARN-së dhe proteinave është thelbësor për lloje të ndryshme studimesh në biologjinë molekulare. Elektroforeza me xhel është një teknikë e cila ndan ADN-në, ARN-në dhe proteinat sipas madhësive të tyre. Nga profilet e xhelit, sekuenca e veçantë e ADN-së, sekuenca e ARN-së ose proteina zbulohen nga teknikat speciale të quajtura blotting dhe hibridizimi me sonda të etiketuara. Ekzistojnë tre lloje të ndryshme metodash fshirjeje, përkatësisht jugore, veriore dhe perëndimore. Dallimi kryesor midis blotting-it verior jugor dhe perëndimor qëndron në llojin e molekulës që zbulon nga një mostër. Southern blotting është një metodë që zbulon një sekuencë specifike të ADN-së nga një mostër e ADN-së. Northern blotting është një teknikë e cila zbulon një sekuencë specifike ARN nga një mostër ARN. Western blotting është një metodë e cila zbulon një proteinë specifike nga një mostër proteine.
Çfarë është Southern Blotting?
Teknika "Southern blotting" u zhvillua nga E. M. Southern në 1975 për identifikimin e një sekuence specifike të ADN-së nga një kampion ADN-je. Kjo është teknika e parë e blotting-it e prezantuar në biologjinë molekulare. Ai mundësoi zbulimin e gjeneve specifike nga ADN-ja, fragmenteve specifike nga ADN-ja, etj. Ka disa hapa të përfshirë në teknikën e blotting-it jugor. Ato janë si më poshtë.
- ADN izolohet nga kampioni dhe tretet me endonukleaza restriktive.
- Mostra e tretur ndahet me elektroforezë me xhel Agarose.
- Fragmentet e ADN-së në xhel janë denatyruar në fije të vetme duke përdorur një tretësirë alkaline.
- ADN me një zinxhir transferohet në një membranë filtri nitrocelulozë nëpërmjet transferimit kapilar.
- ADN-ja e transferuar fiksohet në membranë përgjithmonë.
- ADN e fiksuar në membranë hibridizohet me sonda të etiketuara.
- ADN e palidhur lahet nga membrana duke larë.
- Filmi me rreze X ekspozohet në membranë dhe përgatitet një autoradiograf.
Southern blotting aplikohet për aspekte të ndryshme të biologjisë molekulare. Është i dobishëm në hartimin e RFLP, studimet mjeko-ligjore, metilimin e ADN-së në shprehjen e gjeneve, zbulimin e gjeneve të mutuara në çrregullimet gjenetike, gjurmët e gishtërinjve të ADN-së, etj.
Figura 01: Teknika e fshirjes jugore
Çfarë është Northern Blotting?
Northern blotting është një metodë e krijuar për të zbuluar një sekuencë specifike ARN ose sekuencë mRNA nga një mostër për të studiuar shprehjen e gjeneve. Kjo teknikë u zhvillua nga Alwine, Kemp dhe Stark në vitin 1979. Ajo ndryshon nga teknikat e blotimit jugor dhe perëndimor për shkak të disa hapave. Megjithatë, kjo teknikë kryhet gjithashtu nëpërmjet elektroforezës me xhel, blotting dhe hibridizimit me sonda specifike të etiketuara dhe zbulim. Teknika Northern blotting kryhet si më poshtë.
- ARN nxirret nga kampioni dhe ndahet me elektroforezë xhel.
- ARN transferohet nga xheli në një membranë blotting dhe fiksohet.
- Membrana trajtohet me një sondë të etiketuar të përgatitur nga cDNA ose ARN (sonda është komplementare me një sekuencë specifike në mostër).
- Sonda inkubohet me membranën për t'u lidhur me një sekuencë specifike.
- Sondat e palidhura janë larë.
- Fragmentet e hibridizuara zbulohen nga një autoradiograf.
Northern blotting është një mjet i rëndësishëm në zbulimin dhe kuantifikimin e mRNA të hibridizuar, studimin e degradimit të ARN-së, vlerësimin e gjysmë-jetës së ARN-së, zbulimin e bashkimit të ARN-së, studimin e shprehjes së gjeneve, etj.
Figura 02: Njohja veriore
Çfarë është Western Blotting?
Western blotting është një metodë për të zbuluar një proteinë specifike nga një përzierje proteinash duke përdorur antitrupa të etiketuar. Prandaj, western blot njihet edhe si imunoblot. Kjo teknikë u prezantua nga Towbin et al në 1979 dhe tani kryhet në mënyrë rutinore në laboratorë për analizën e proteinave. Hapat janë si më poshtë.
- Proteinat nxirren nga kampioni
- Proteinat ndahen sipas madhësive të tyre duke përdorur elektroforezë me xhel poliakrilamid
- Molekulat e ndara transferohen në një membranë PVDF ose membranë nitroceluloze me anë të elektroporimit
- Membrana është e bllokuar për lidhje jospecifike me antitrupat
- Proteinat e transferuara lidhen me antitrupat primar (antitrupa të etiketuar me enzimë).
- Membrana lahet për të hequr antitrupat parësorë të lidhur në mënyrë jo specifike
- Antrupat e lidhur zbulohen duke shtuar një substrat dhe duke zbuluar precipitatin me ngjyrë të formuar
Western blotting është i dobishëm në zbulimin e antitrupave anti-HIV në një kampion serumi njerëzor. Western blot mund të përdoret gjithashtu si një test konfirmues për infeksionin e hepatitit B dhe test përfundimtar për sëmundjen e lopës së çmendur.
Figura 03: Western Blotting
Cili është ndryshimi midis Blotting-it Verior Jugor dhe Perëndimor?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Lloji i molekulës u zbulua | |
| Northern Blotting | Northern blotting zbulon një sekuencë specifike ARN nga një kampion ARN. |
| Southern Blotting | Southern blotting zbulon një sekuencë specifike të ADN-së nga një kampion ADN. |
| Western Blotting | Western blotting zbulon një proteinë specifike nga një mostër proteine. |
| Lloji i xhelit | |
| Northern Blotting | Kjo përdor xhel agarozë/formaldehid. |
| Southern Blotting | Kjo përdor një xhel Agarose. |
| Western Blotting | Kjo përdor xhel poliakrilamid. |
| Metoda e fshirjes | |
| Northern Blotting | Ky është një transferim kapilar. |
| Southern Blotting | Ky është një transferim kapilar. |
| Western Blotting | Ky është një transferim elektrik. |
| Sonda të përdorura | |
| Northern Blotting | sonda cDNA ose ARN të etiketuar në mënyrë radioaktive ose jo radioaktive. |
| Southern Blotting | Sondat e ADN-së janë etiketuar në mënyrë radioaktive ose jo radioaktive. |
| Western Blotting | Antrupat primare përdoren si sonda. |
| Sistemi i zbulimit | |
| Northern Blotting | Kjo bëhet duke përdorur një autoradiograf ose zbulimin e ndryshimit të dritës ose ngjyrës. |
| Southern Blotting | Kjo bëhet duke përdorur një autoradiograf, zbulimin e ndryshimit të dritës ose ngjyrës. |
| Western Blotting | Kjo bëhet duke përdorur zbulimin e ndryshimit të dritës ose ngjyrës. |
Përmbledhje – Njohja veriore vs jugore vs perëndimore
Blotting është një teknikë e veçantë e zhvilluar për identifikimin e ADN-së, ARN-së ose proteinës specifike nga mostrat. Ekzistojnë tre procedura të veçanta blotimi, përkatësisht veriore, jugore dhe perëndimore, për të zbuluar një lloj specifik molekule. Teknika Northern blotting është projektuar për të zbuluar një sekuencë specifike të ARN-së nga një përzierje e ARN-së. Teknika Southern blotting mundëson zbulimin e një sekuence specifike të ADN-së nga një mostër e ADN-së dhe teknika western blotting është zhvilluar për të identifikuar një proteinë specifike nga një përzierje proteinash.
