Dallimi kryesor – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green dhe Taqman janë dy metoda të përdorura për të zbuluar ose parë procesin e amplifikimit të PCR në kohë reale. SYBR Green është një metodë e bazuar në ndërthurjen e ngjyrosjes së acidit nukleik ndërsa Taqman është një metodë e bazuar në sondën e hidrolizës. Të dyja teknologjitë janë krijuar për të gjeneruar fluoreshencë gjatë PCR, e cila lejon makinën PCR në kohë reale të monitorojë reagimin në "kohë reale". Metoda SYBR Green kryhet duke përdorur një bojë fluoreshente të quajtur SYBR jeshile dhe zbulon amplifikimin duke e lidhur bojën me ADN-në e prodhuar me dy vargje. Taqman kryhet duke përdorur sonda me etiketa të dyfishta dhe zbulon amplifikimin nga degradimi i sondës nga Taq polimeraza dhe lëshimet e fluoroforit. Ky është ndryshimi kryesor midis SYBR Green dhe Taqman.
Çfarë është SYBR Green?
SYBR Green është një bojë fluoreshente që përdoret për të ngjyrosur acidet nukleike, veçanërisht ADN-në me dy fije floku në Biologjinë Molekulare. Metoda SYBR Green përdoret për të përcaktuar sasinë e produkteve PCR gjatë PCR në kohë reale. Pasi të lidhet me ADN-në, kompleksi i ngjyrës së ADN-së që rezulton thith dritën blu dhe lëshon dritë jeshile intensive. Ndodh për shkak të ndryshimit strukturor që ndodh në molekulën e bojës pas lidhjes me ADN-në me dy fije. Kur PCR krijon gjithnjë e më shumë ADN, më shumë molekula ngjyruese lidhen me ADN-në, duke gjeneruar më shumë fluoreshencë. Prandaj, fluoreshenca rritet me akumulimin e produktit PCR. Prandaj, sasia e produktit PCR mund të matet në mënyrë sasiore nga zbulimi i fluoreshencës SYBR Green.
Ngjyra jeshile SYBR mund të përdoret gjithashtu për etiketimin e ADN-së në citometri dhe mikroskopi fluoreshente. Bromidi etidium është zëvendësuar me sukses nga SYBR Green pasi bromidi etidium është një bojë kancerogjene me probleme asgjësimi gjatë vizualizimit të ADN-së në elektroforezën e xhelit.
Ka avantazhe dhe disavantazhe të metodës së gjelbër SYBR. Kjo metodë është shumë e ndjeshme, e lirë dhe e lehtë për t'u përdorur. Megjithatë, për shkak të aftësisë së saj për t'u lidhur me çdo ADN me dy zinxhirë, lidhja jospecifike mund të çojë në mbikuantifikimin e produktit PCR.
Figura 01: Teknika e Gjelbër SYBR
Çfarë është Taqman?
Taqman është një metodë alternative ndaj SYBR Green për të monitoruar procesin e PCR në kohë reale. Kjo metodë varet nga aktiviteti i ekzonukleazës 5’ – 3’ të enzimës së polimerazës Taq për të degraduar sondat gjatë shtrirjes së vargut të ri dhe lëshimit të fluoroforit. Në këtë metodë përdoren sonda me etiketa të dyfishta dhe bazohet në hidrolizën e sondave. Sondat janë oligonukleotide të etiketuara në mënyrë fluoreshente të ADN-së që kanë një molekulë raportuese fluoreshente (fluorofore) në skajin 5' dhe një molekulë shuarëse në skajin 3'. Ato janë të dizajnuara për t'u lidhur me shabllonin e vetëm me zinxhir në anën e kundërt të pjekjes së primerit. Taq polimeraza shton nukleotide në primer dhe zgjeron vargun e ri drejt sondave me etiketa të dyfishta. Sapo polimeraza Taq takohet me sondën, veprimi i ekzonukleazës së polimerazës Taq aktivizon dhe degradon sondë. Pasi përfundon sintezën e vargut të ri, sonda i nënshtrohet degradimit të plotë dhe lëshon fluoroforin. Lëshimi i fluoroforit gjeneron fluoreshencë. Molekula fluoreshente Quencher shuan në mënyrë efikase dritën e emetuar dhe krijon rezultatin për përcaktimin sasior të produktit PCR. Lëshimi i fluoroforeve dhe sasia e produkteve PCR janë proporcionale. Prandaj, kuantifikimi mund të bëhet lehtësisht me metodën Taqman.
Figura 02: Metoda Taqman
Metoda Taqman përdoret në PCR në kohë reale, kuantifikimi i shprehjes së gjeneve, zbulimi i polimorfizmave gjenetike, kuantifikimi i fshirjeve të ADN-së kromozomike, identifikimi i baktereve, verifikimi i analizës së mikroarresë, gjenotipizimi i SNP etj.
Cili është ndryshimi midis gjelbërimit SYBR dhe Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Gjelbër bazohet në ngjyrën lidhëse të ADN-së. | Taqman varet nga sondat e hibridizimit dhe aktiviteti i ekzonukleazës 5' deri në 3' të polimerazës Taq. |
| Sonda të etiketuara me fluoreshente | |
| Nuk kërkohen sonda të etiketuara fluoreshente. | Kërkohen sonda me etiketa të dyfishta. |
| Analiza e gjenit Multipleks | |
| Nuk mund të përdoret për objektivat e gjenit të shumëfishtë. | Mund të përdoret për objektivat e gjenit të shumëfishtë. |
| Kosto | |
| Kjo është më pak e shtrenjtë. | Kjo është më e shtrenjtë. |
| Specifikiteti | |
| Kjo është më pak specifike dhe lidhet me çdo ADN të dyfishtë | Këto janë shumë specifike pasi sondat zbulojnë produktet specifike të amplifikimit. |
| efektivitet | |
| Kjo është më pak efektive. | Kjo është shumë efektive. |
| Aplikacion | |
| Kjo përdoret në PCR në kohë reale, vizualizimi i xhelit të agarozës, etiketimi i ADN-së etj. | Kjo përdoret në PCR në kohë reale, kuantifikimi i shprehjes së gjeneve, zbulimi i polimorfizmave gjenetike, etj. |
Përmbledhje – SYBR Green dhe Taqman
Taqman dhe SYBR jeshile janë dy metoda të përdorura në PCR në kohë reale (PCR sasiore). Të dyja metodat mundësojnë kuantifikimin e produktit PCR në mënyrë efikase dhe mbështeten në emetimin e fluoreshencës. Metoda Taqman përdor sonda me etiketa të dyfishta për zbulimin e ADN-së së akumuluar ndërsa metoda SYBR Green përdor një ngjyrë fluoreshente. Të dyja këto metoda kanë gjithashtu aplikime të ndryshme në biologjinë molekulare.
