Dallimi kryesor – Nick Translation vs Primer Extension
Përkthimi i nofkës dhe zgjatja e primerit janë dy teknika të rëndësishme të kryera në biologjinë molekulare. Dallimi kryesor midis përkthimit të nofkës dhe shtrirjes së primerit është se procesi i përkthimit të nofkës prodhon sonda të etiketuara për teknika të tjera hibridizimi ndërsa metoda e zgjerimit të primerit identifikon një sekuencë specifike të ARN-së nga një përzierje dhe zbulon informacion në lidhje me shprehjen e mRNA. Të dyja teknikat kanë një rëndësi të madhe dhe kryhen në mënyrë rutinore në laboratorët e kërkimit molekular.
Çfarë është Nick Translation?
Përkthimi me nick është një teknikë e rëndësishme që përdoret për përgatitjen e sondave të etiketuara për teknika të ndryshme biologjike molekulare si blotting, hibridizimi in situ, hibridizimi fluoreshent in situ etj. Është një metodë in vitro e etiketimit të ADN-së. Sondat e ADN-së përdoren për të identifikuar sekuenca specifike të ADN-së ose ARN-së. Me ndihmën e një sondë të etiketuar, fragmente specifike mund të shënohen ose vizualizohen nga një përzierje komplekse e acidit nukleik. Prandaj, sondat e etiketuara përgatiten duke përdorur teknika të ndryshme për t'u përdorur për teknika të ndryshme. Nick translation është një metodë e tillë që prodhon sonda të etiketuara me ndihmën e enzimave DNase 1 dhe ADN polimeraza 1.
Procesi i përkthimit të nofkës fillon me aktivitetin e enzimës DNase 1. DNaza 1 prezanton gërvishtjet në shtyllën kurrizore të fosfatit të ADN-së me dy zinxhirë duke shkëputur lidhjet fosfodiesterike midis nukleotideve. Pasi të krijohet nick, do të prodhohet grupi i lirë 3' OH i nukleotidit dhe enzima e ADN polimerazës 1 do të veprojë mbi të. Aktiviteti i ekzonukleazës 5' deri në 3' i ADN polimerazës 1 largon nukleotidet nga gryka drejt drejtimit 3' të vargut të ADN-së. Njëkohësisht, aktiviteti i polimerazës i enzimës së ADN polimerazës 1 funksionon dhe shton nukleotide për të zëvendësuar nukleotidet e hequra. Nëse nukleotidet janë etiketuar, zëvendësimi do të ndodhë nga nukleotidet e etiketuara dhe do të shënojë ADN-në për identifikim. Kjo ADN e etiketuar e sapo sintetizuar mund të përdoret si sondë në reaksione të ndryshme hibridizimi në Biologjinë Molekulare.
Figura 01: Procesi i përkthimit të Nick
Çfarë është Primer Extension?
Zgjatja e primerit është një teknikë e cila përdoret për të gjetur sekuencën specifike të ARN-së nga një përzierje ARN dhe për të lokalizuar skajin 5' të transkriptit të mRNA. Përdoret gjithashtu për të studiuar strukturën e ARN-së dhe shprehjen. Metoda e zgjatjes së primerit kryhet me abetare të etiketuar ose me nukleotide të etiketuara. Nëse përdoren primerë të etiketuar, kjo përjashton nevojën e etiketimit të nukleotideve që përdoren për sintezën e cADN-së. Ka disa hapa në këtë teknikë. Fillon me nxjerrjen e ARN-së nga kampioni. Pastaj një primer oligonukleotid i etiketuar i shtohet përzierjes së bashku me përbërësit e nevojshëm për të sintetizuar cDNA të një sekuence specifike ARN. Primeri pjekje me sekuencën plotësuese nga përzierja. Duke përdorur sekuencën e pjekjes së primerit si shabllon, enzima e transkriptazës së kundërt sintetizon ADN-në plotësuese (cDNA) të sekuencës së ARN-së. Pjekja e primerit dhe transkriptimi i kundërt ndodhin vetëm kur sekuenca specifike e ARN-së është e pranishme në mostër. Së fundi, kur kryhet elektroforeza e xhelit denatyrues, mund të përcaktohet madhësia e sekuencës së ARN-së. Është gjithashtu e lehtë të gjesh bazën +1 të sekuencës së mRNA (vendit të fillimit të transkriptimit) me metodën e zgjerimit të primerit. Sasia e mARN-së e pranishme në kampion mund të matet me këtë metodë nëse përdoret abetare e tepërt.
Figura 02: Zgjatja e primerit
Cili është ndryshimi midis Nick Translation dhe Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Përkthimi i Nick është një proces që krijon sonda të etiketuara të ADN-së për reaksione të ndryshme hibridizimi. | Zgjatja e primerit është një teknikë e përdorur për të gjetur ARN specifike ose për të studiuar shprehjen e gjeneve. |
| Enzimat e përdorura | |
| Përdoren enzimat DNase 1 dhe ADN polimeraza. | Përdoret enzima e anasjelltë e transkriptazës. |
| Rëndësia | |
| Përkthimi i nofkës lehtëson shënimin e sekuencës specifike të ADN-së. | Zgjatja e primerit mundëson zbulimin e madhësisë specifike të sekuencës së mRNA dhe sasisë së pranishme në mostër. |
Përmbledhje – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translation është një metodë e përdorur për të sintetizuar sondat e etiketuara bazuar në aktivitetet e enzimave të DNase 1 dhe E coli ADN polimeraza 1. Është një metodë in vitro e përdorur në laboratorë përpara teknikave të ndryshme të hibridizimit. Gjatë përkthimit të nofkës, aktiviteti i ekzonukleazës 5'-3' i ADN polimerazës 1 heq nukleotidet përpara nickës dhe aktiviteti i polimerazës i ADN polimerazës 1 zëvendëson nukleotidet e hequra me nukleotide të etiketuara pas nofkës. Zgjatja e primerit është një metodë që përdoret për të zbuluar një transkript specifik të ARN-së nga një përzierje dhe për të përcaktuar sasinë dhe sasinë e ARN-së së interesit. Ky është ndryshimi midis përkthimit të nofkës dhe zgjerimit të primerit.
