Diferenca kryesore – Mikroarray kundrejt sekuencës së ARN-së
Transkriptoma përfaqëson të gjithë përmbajtjen e ARN-së të pranishme në një qelizë duke përfshirë mRNA, rRNA, tARN, ARN të degraduar dhe ARN të padegraduar. Profilizimi i transkriptomës është një proces i rëndësishëm për të kuptuar njohuritë e qelizave. Ekzistojnë disa metoda të avancuara për profilizimin e transkriptomit. Sekuenca e mikroarray dhe ARN janë dy lloje teknologjish të zhvilluara për të analizuar transkriptomën. Dallimi kryesor midis sekuencës së mikrovargëve dhe ARN-së është se mikroarregjia bazohet në potencialin e hibridizimit të sondave të etiketuara të paracaktuara me sekuencat e synuara të cDNA-së ndërsa sekuenca e ARN-së bazohet në sekuencën e drejtpërdrejtë të vargjeve të cDNA nga teknika të avancuara të sekuencës si NGS. Microarray kryhet me njohuri paraprake për sekuencat dhe sekuenca e ARN-së kryhet pa njohuri paraprake për sekuencat.
Çfarë është Microarray?
Microarray është një metodë e fuqishme, e besueshme dhe me kapacitet të lartë të përdorur për profilizimin e transkriptimit nga shkencëtarët. Është qasja më popullore për analizën e transkriptit. Është një metodë me kosto të ulët, e cila varet nga sondat e hibridizimit.
Teknika fillon me nxjerrjen e mRNA nga kampioni dhe ndërtimin e bibliotekës cDNA nga ARN totale. Më pas përzihet me sonda të paradizajnuara të etiketuara në mënyrë fluoreshente në një sipërfaqe të fortë (matricë pikash). Sekuencat plotësuese hibridizohen me sondat e etiketuara në mikrovarg. Më pas mikrovargu lahet dhe kontrollohet, dhe imazhi matet në sasi. Të dhënat e mbledhura duhet të analizohen për të marrë profilet e shprehjes relative.
Intensiteti i sondave të mikrogrumbullimit supozohet të jetë proporcional me sasinë e transkripteve në mostër. Megjithatë, saktësia e teknikës varet nga sondat e projektuara, njohuritë paraprake të sekuencës dhe afiniteti i sondave për hibridizimin. Prandaj, teknologjia e mikroarrejve ka kufizime. Teknika e mikroarrejve nuk mund të kryhet me transkripta me bollëk të ulët. Ai nuk arrin të diferencojë izoformat dhe të identifikojë variantet gjenetike. Meqenëse kjo metodë varet nga hibridizimi i sondave, disa probleme që lidhen me hibridizimin si hibridizimi i kryqëzuar, hibridizimi jospecifik etj. ndodhin në teknikën e mikrovargëve.
Figura 01: Microarray
Çfarë është sekuenca e ARN?
Sekuenca e ARN-së me armë gjahu (ARN seq) është një teknikë e zhvilluar kohët e fundit e renditjes së plotë të transkriptomit. Është një metodë e shpejtë dhe e lartë e profilizimit të transkriptimit. Ai përcakton drejtpërdrejt shprehjen e gjeneve dhe rezulton në një hetim të thellë të transkriptomit. Seq i ARN-së nuk varet nga sondat e paradizajnuara ose nga njohuritë paraprake të sekuencave. Prandaj, metoda e seq ARN ka ndjeshmëri të lartë dhe aftësi për të zbuluar gjenet e reja dhe variantet gjenetike.
Metoda e renditjes së ARN kryhet nëpërmjet disa hapave. ARN totale e qelizës duhet të izolohet dhe të fragmentohet. Më pas, duke përdorur transkriptazën e kundërt, duhet të përgatitet një bibliotekë cDNA. Çdo varg cADN duhet të lidhet me adaptorë. Pastaj fragmentet e lidhura duhet të përforcohen dhe pastrohen. Së fundi, duke përdorur një metodë NGS, duhet të kryhet sekuenca e cDNA-së.
Figura 02: Sekuenca e ARN-së
Cili është ndryshimi midis sekuencës së mikroarray dhe ARN?
Microarray vs Sekuenca ARN |
|
| Microarray është një metodë e fuqishme, e besueshme dhe me kapacitet të lartë. | Sekuenca e ARN-së është një metodë e saktë dhe me performancë të lartë. |
| Kosto | |
| Kjo është një metodë me kosto të ulët. | Kjo është një metodë e shtrenjtë. |
| Analiza e një numri të madh mostrash | |
| Kjo lehtëson analizimin e një numri të madh mostrash në të njëjtën kohë. | Kjo lehtëson analizimin e një numri të madh mostrash. |
| Analiza e të dhënave | |
| Analiza e të dhënave është komplekse. | Më shumë të dhëna krijohen në këtë metodë; prandaj, procesi është më kompleks. |
| Njohuri paraprake për sekuencat | |
| Kjo metodë bazohet në sondat e hibridizimit, kështu që kërkohet njohuri paraprake e sekuencave. | Kjo metodë nuk varet nga njohuritë e mëparshme të sekuencës. |
| Variantet strukturore dhe gjenet e reja | |
| Kjo metodë nuk mund të zbulojë variacionet strukturore dhe gjenet e reja. | Kjo metodë mund të zbulojë variacione strukturore si shkrirja e gjeneve, bashkimi alternativ dhe gjenet e reja. |
| Ndjeshmëri | |
| Kjo nuk mund të zbulojë ndryshime në shprehjen e izoformave, kështu që kjo ka ndjeshmëri të kufizuar. | Kjo ka ndjeshmëri të lartë. |
| Rezultati | |
| Kjo mund të rezultojë vetëm në nivele relative të shprehjes. Kjo nuk jep sasinë absolute të shprehjes së gjeneve. | Jep nivele shprehjeje absolute dhe relative. |
| Ranaliza e të dhënave | |
| Kjo duhet të riprodhohet në mënyrë që të rianalizohet. | Të dhënat e renditjes mund të rianalizohen. |
| Nevoja për personel dhe infrastrukturë specifike | |
| Infrastruktura dhe personeli specifik nuk kërkohet për grupin mikro. | Infrastruktura dhe personeli specifik i kërkuar nga sekuenca e ARN-së. |
| Çështje teknike | |
| Teknika e mikroarresë ka probleme teknike si hibridizimi i kryqëzuar, hibridizimi jospecifik, shpejtësia e kufizuar e zbulimit të sondave individuale, etj. | Teknika ARN seq shmang çështjet teknike si hibridizimi i kryqëzuar, hibridizimi jospecifik, shpejtësia e kufizuar e zbulimit të sondave individuale, etj. |
| paragjykime | |
| Kjo është një metodë e njëanshme pasi varet nga hibridizimi. | Paragjykimi është i ulët në krahasim me grupin mikro. |
Përmbledhje – Microarray vs Sekuenca ARN
Metodat e sekuencës së mikrovargëve dhe ARN-së janë platforma me kapacitet të lartë të zhvilluara për profilizimin e transkriptomit. Të dyja metodat prodhojnë rezultate të cilat janë shumë të lidhura me profilet e shprehjes së gjeneve. Sidoqoftë, sekuenca e ARN-së ka përparësi ndaj mikrovargëzimit për analizën e shprehjes së gjeneve. Sekuenca e ARN-së është një metodë më e ndjeshme për zbulimin e transkripteve me bollëk të ulët sesa mikrogrumbullimi. Sekuenca e ARN-së gjithashtu mundëson diferencimin midis izoformave dhe identifikimin e varianteve të gjeneve. Sidoqoftë, mikroarreja është zgjedhja e zakonshme e shumicës së studiuesve pasi sekuenca e ARN-së është një teknikë e re dhe e shtrenjtë me sfida të ruajtjes së të dhënave dhe analiza komplekse të të dhënave.
