Diferenca kryesore – RT PCR vs QPCR
Reaksioni zinxhir i polimerazës është një teknikë e përdorur për të amplifikuar një rajon specifik të ADN-së in vitro. Për shkak të shpikjes së kësaj teknike nga Kary Mullis në vitin 1983, shkencëtarët janë në gjendje të bëjnë mijëra deri në miliona kopje të fragmenteve specifike të ADN-së për qëllime kërkimore. Aktualisht është bërë një teknikë e zakonshme dhe e kryer në mënyrë rutinore në laboratorët klinikë dhe kërkimorë për një shumëllojshmëri të gjerë aplikimesh. Ka variacione të teknikës tradicionale të PCR si RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, etj. RT PCR dhe Q PCR janë dy variacione të rëndësishme të PCR. Dallimi kryesor midis RT PCR dhe Q PCR është se RT PCR përdoret për të zbuluar shprehjen e gjeneve përmes krijimit të transkripteve plotësuese të ADN-së (cDNA) nga ARN ndërsa Q PCR përdoret për të matur në mënyrë sasiore produktet PCR në kohë reale duke përdorur ngjyra fluoreshente.
Çfarë është RT PCR?
Reaksioni zinxhir i polimerazës së transkriptimit të kundërt (RT PCR) është një variant i PCR që përdoret për të zbuluar shprehjen e ARN-së. Është një metodë shumë e rëndësishme për zbulimin e shprehjes së mRNA në inde. RT PCR përdoret kur materiali fillestar i kampionit është ARN. Në RT PCR, ARN-ja e shabllonit konvertohet fillimisht në ADN plotësuese. Ky hap katalizohet nga enzima e kundërt transkriptazë dhe procesi njihet si transkriptim i kundërt. Së dyti, PCR tradicionale përdoret për cDNA-në e saposintetizuar për amplifikimin.
RT PCR është një teknikë shumë e ndjeshme që kërkon një sasi relativisht të vogël të mostrës së ARN-së. RT PCR përdoret zakonisht në diagnostikimin dhe kuantifikimin e specieve të ARN-së, veçanërisht viruseve ARN si virusi i mungesës së imunitetit të njeriut dhe virusi i hepatitit C.
Figura 01: Teknika RT PCR
Çfarë është QPCR?
PCR sasiore (QPCR) është një variant i PCR i cili përdoret për të matur në mënyrë sasiore produktet e PCR. Gjithashtu referohet si reaksion zinxhir polimerazë në kohë reale pasi mat amplifikimin e kohës reale duke përdorur makinën PCR në kohë reale. Është një metodë e përshtatshme për përcaktimin e sasisë së një sekuence të synuar ose gjenit të pranishëm në një mostër. Karakteristika interesante e QPCR është se ai kombinon të dyja amplifikimin dhe sasinë e vërtetë në një hap të vetëm. Prandaj, nevoja për elektroforezë xhel në zbulim mund të eliminohet me teknikën QPCR. QPCR përdor ngjyra fluoreshente për të etiketuar produktet PCR gjatë reaksioneve PCR të cilat përfundimisht çojnë në kuantifikimin e drejtpërdrejtë. Kur produktet PCR grumbullohen, akumulohen edhe sinjalet fluoreshente dhe do të maten nga makineri në kohë reale. QPCR mund të kombinohet me RT PCR. Njihet si RT – QPCR ose QRT – PCR dhe konsiderohet si metoda më e fuqishme, e ndjeshme dhe sasiore për zbulimin e niveleve të ARN-së në qeliza ose inde.
SYBR Green dhe Taqman janë dy metoda të përdorura për të zbuluar ose parë procesin e amplifikimit të PCR në kohë reale. Metoda SYBR Green kryhet duke përdorur një bojë fluoreshente të quajtur SYBR jeshile dhe zbulon amplifikimin duke lidhur bojën për të prodhuar ADN me dy fije. Taqman kryhet duke përdorur sonda me etiketa të dyfishta dhe zbulon amplifikimin nga degradimi i sondës nga Taq polimeraza dhe çlirimet e fluoroforit siç tregohet në figurën 02. Të dyja metodat monitorojnë ecurinë e procesit të amplifikimit dhe raportojnë sasinë e produktit në kohë reale.
PCR në kohë reale ka një shumëllojshmëri të gjerë aplikimesh si kuantifikimi i shprehjes së gjeneve, analiza e mikroRNA dhe ARN jokoduese, gjenotipizimi i SNP, zbulimi i varianteve të numrit të kopjeve, zbulimi i mutacioneve të rralla, zbulimi i organizmave të modifikuar gjenetikisht, zbulimi i agjentëve infektivë., etj.
Figura 02: Teknika sasiore PCR
Cili është ndryshimi midis RT PCR dhe QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR është një teknikë që përdoret për të zbuluar shprehjen e gjeneve me anë të amplifikimit. | QPCR është një teknikë që amplifikon ADN-në dhe kuantifikon produktet PCR në kohë reale. |
| Përfshirja e enzimës së transkriptazës së kundërt | |
| Enzima e transkriptazës së kundërt përdoret për RT PCR. | Enzima transkriptaza e kundërt nuk përdoret për QPCR. |
| Përdorimi i molekulave të etiketuara me fluoreshente | |
| Ngjyrat ose sondat e etiketuara me fluoreshente nuk përdoren për RT PCR. | Ngjyrat ose sondat e etiketuara me fluoreshente përdoren për QPCR. |
| Sasia e produktit PCR | |
| Përveç rastit kur shoqërohet me QPCR, RT PCR nuk e përcakton sasinë e produktit PCR. | QPCR matë në mënyrë sasiore produktin PCR. |
| Materiali fillestar | |
| Materiali fillestar është mARN. | Materiali fillestar është ADN. |
| Sinteza e cDNA | |
| ADN plotësuese prodhohet gjatë RT PCR. | ADN-ja plotësuese nuk prodhohet gjatë QPCR. |
Përmbledhje – RT PCR vs QPCR
RT PCR dhe QPCR janë dy versione të PCR tradicionale. Teknika RT PCR kryhet për mostrat e mRNA dhe drejtohet nga transkriptimi i kundërt dhe prodhimi i cDNA. QPCR përdoret për të përcaktuar sasinë e produkteve PCR gjatë cikleve termike PCR në kohë reale duke përdorur ngjyra fluoreshente ose sonda të etiketuara. Në QPCR, sasia e produktit PCR përfaqësohet nga sinjalet fluoreshente të emetuara nga kampioni. RT PCR përdoret gjerësisht si një proces amplifikimi ndërsa QPCR përdoret zakonisht si një proces kuantifikimi. Ky është ndryshimi midis RT PCR dhe QPCR.
